Rôle de la traduction dans la dégradation des longs ARNs non codants antisens chez la levure

Role of translation in the degradation of antisense long non-coding RNAs in yeast

• Auteur / Autrice : Sara Andjus
• Direction : Antonin Morillon, Maxime Wery
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et développement
• Date : Soutenance le 20/10/2022
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Dynamique de l'information génétique : bases fondamentales et cancer (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie (Paris ; 1978-....)
• Jury : Président / Présidente : Alice Lebreton
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Antonin Morillon, Maxime Wery, Anne-Ruxandra Carvunis, David Tollervey, Olivier Namy
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Anne-Ruxandra Carvunis, David Tollervey

Mots clés

Mots clés libres

ARNlnc

Xrn1

Nmd

Traduction

DsRNA

Levure

LncRNA

Xrn1

Nmd

Translation

DsRNA

Yeast

Résumé

Issus de la transcription pervasive des génomes eucaryotes, les longs ARN non codants (nc) sont aujourd’hui reconnus comme des acteurs clés dans divers processus cellulaires. Ils présentent une expression spécifique du tissu ou type cellulaire, et répondent à divers stimuli, suggèrant que leur expression est contrôlée. Leur dérégulation est associée à des maladies humaines, dont le cancer.Parmi les différents longs ARNnc, les ARN antisens (as) sont synthétisés à partir du brin opposé aux gènes codant des protéines. Malgré leur potentiel régulateur, les ARNas restent peu étudiés, à cause de leur faible abondance cellulaire. En fait, chez la levure, ils sont largement dégradés par l'exosome nucléaire et l'exoribonucléase cytoplasmique Xrn1.Des travaux récents menés chez Saccharomyces cerevisiae ont révélé que les ARNas sont ciblés vers Xrn1 par la voie du Nonsense-Mediated mRNA Decay (NMD) qui dépend de la traduction. Cette sensibilité au NMD suggère que les ARNas sont traduits, soulevant la question de leur potentiel codant. D'autre part, les ARNas peuvent former des structures ARN double brin avec les ARNm ‘sens’, les protégeant du NMD. Cependant, les mécanismes moléculaires qui régulent le ciblage des ARNas vers la traduction/dégradation ou l’appariement/stabilisation restent inconnus.Pour mieux comprendre cette problématique, ma thèse visait à étudier la conservation des mécanismes de dégradation dans le contrôle de ARNas, le rôle de la traduction dans ce processus, ainsi que l'hétérogénéité de l’appariement sens/antisens chez la levure.Tout d'abord, nous avons étudié la dégradation des ARNas chez Naumovozyma castellii, qui contrairement à S. cerevisiae contient le système d’interférence par ARN (ARNi), en examinant l'interaction entre l'exosome nucléaire, Xrn1 et la RNase III Dicer. Nos données ont montré que la dégradation des ARNas dans cette espèce dépend de l'exosome nucléaire et de Xrn1, sans effet majeur de Dicer (Szachnowski*, Andjus* et al., 2019). Elles suggèrent également que la présence de la machinerie d'ARNi cytoplasmique chez N. castellii a renforcé le rôle de l’exosome nucléaire pour restreindre l'expression des ARNas.Chez S. cerevisiae, nous avons montré que les ARNas s'accumulent dans des conditions d'inhibition de l’élongation de la traduction, renforçant l'idée que la traduction détermine leur dégradation. Des analyses Ribo-Seq (en collaboration avec le laboratoire du Dr. Namy à l'I2BC, Gif sur Yvette) ont permis de montrer que les ARNas cytoplasmiques sont activement traduits. De plus, nous avons identifié les bases moléculaires qui ciblent les ARNas vers le NMD. Enfin, nous avons montré qu’un peptide est produit à partir d’un ARNas rapporteur sensible au NMD, et est détecté dans des cellules sauvages, alors que ce transcrit est ciblé vers la dégradation via le NMD. Ces résultats sont décrits dans un preprint déposé sur bioRxiv (Andjus et al., 2022), tandis que l'importance évolutive du NMD dans la modulation des ARNnc a fait l'objet de la revue publiée dans Noncoding RNA (Andjus et al., 2021).Enfin, nous avons pu démontrer la large hétérogénéité de la co-expression des ARNm sens/ARNas à l'échelle du génome, en utilisant les données RNA-Seq de cellules uniques (en collaboration avec le laboratoire du Dr. Posas à l'IRB, Barcelone). De plus, nous avons observé une corrélation entre l'augmentation du niveau des ARNas et le nombre de cellules contenant à la fois l’ARNm sens et et son as, soulevant la question de l'impact de la formation de duplex sur le destin des ARN impliqués.En conclusion, mon projet contribue à reconsidérer l'idée que les ARNas sont dépourvus de potentiel codant, mettant en évidence le rôle de la traduction dans leur dégradation via le NMD. Ce travail chez la levure ouvre des perspectives quant à la régulation des ARNas chez les Eucaryotes supérieurs (les facteurs NMD qui les ciblent étant conservés), et quant au rôle régulateur potentiel des peptides dérivés des ARNas.

Initially thought to be by-products of the pervasive transcription of eukaryotic genomes, long non-coding (lncRNAs) progressively emerged as key players in multiple cellular processes. LncRNAs show tissue-specific expression and respond to diverse stimuli, suggesting that their expression is precisely controlled. Their dysregulated expression has been associated to human diseases, including cancer. Several classes of lncRNAs exist, including antisense (as)lncRNAs that are synthesized from the strand opposite to sense protein-coding genes. Despite their regulatory importance, aslncRNAs have been poorly explored due to their low cellular abundance. In fact, in yeast they are extensively targeted by RNA decay machineries – nuclear exosome and cytoplasmic Xrn1 exoribonuclease.Recent works in Saccharomyces cerevisiae revealed that aslncRNAs are mainly targeted to Xrn1 through translation-dependent Nonsense-Mediated Decay (NMD) pathway. The NMD-sensitivity of aslncRNAs suggests that they are translated, raising the question of their coding potential. On the other hand, aslncRNAs can also form double-stranded RNA with their paired-sense mRNAs, at least in some cells, protecting them from NMD. However, the extent and the regulatory mechanisms governing the fate of the aslncRNA either subjected to translation/decay or pairing/stabilization are unknown.In this context, to enlighten the metabolism of aslncRNA, the objective of my thesis was to decipher the evolutionary role of decay machineries in controlling aslncRNAs expression, the role of translation in the degradation of aslncRNAs, and the heterogeneity of sense mRNA and aslncRNAs in yeast.First, we studied aslncRNAs degradation in Naumovozyma castellii, a budding yeast endowed with RNAi, unlike S. cerevisiae, which lost it during evolution, by examining the interplay between the nuclear exosome, Xrn1 and the RNase III Dicer. Our data showed that aslncRNAs decay in this species depends on the nuclear exosome and Xrn1 (with no major effect of Dicer) (Szachnowski*, Andjus* et al., 2019). They also suggest that the presence of cytoplasmic RNAi machinery in N. castellii reinforced nuclear RNA surveillance machinery to temper aslncRNAs expression.In S. cerevisiae, we showed that aslncRNAs accumulate upon translation elongation inhibition, reinforcing the idea that translation controls their decay. Using Ribo-Seq (in collaboration with Dr. Namy’s lab at I2BC, Gif sur Yvette) we defined actively translated aslncRNAs. We demonstrated the molecular bases subjecting aslncRNAs to NMD. Finally, we showed that a peptide is produced from an NMD-sensitive aslncRNA reporter, and is detected in wild-type cells, while the transcript is targeted for degradation via NMD. These results are described in a preprint deposited on bioRxiv (Andjus et al., 2022), while the evolutionary importance of NMD in ncRNA modulation was the subject of the review published in Noncoding RNA (Andjus et al., 2021).Lastly, using single-cell RNA-Seq data (in collaboration with Dr. Posas’s lab at IBR, Barcelona), we observed a large heterogeneity of co-expression of sense mRNA/aslncRNAs at the single cell level genome wide, critical for the metabolism of aslncRNAs. Moreover, we showed a direct correlation between aslncRNAs levels and the number of cells containing both sense and as RNA pairs, raising an intriguing hypothesis on the mechanistic impact of duplex formation on the fate of the involving pair.In conclusion, my project contributed to reconsider that aslncRNAs are devoid of coding potential, highlighting the role of translation in determining their degradation via the NMD. As the NMD factors targeting them are conserved, this work in yeast helps comprehend the aslncRNAs metabolism in higher Eukaryotes. Our work also opens perspectives regarding the possible regulatory roles of the aslncRNA-derived peptides.