Base mécanistique et structurelle pour la régulation de l'activité de la myosine

Mechanistic and structural basis for tuning of myosin activity

• Auteur / Autrice : Louise Canon
• Direction : Anne Houdusse
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et développement
• Date : Soutenance le 19/10/2022
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie (Paris ; 1978-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie Cellulaire et Cancer
• Jury : Président / Présidente : Carine Tisné
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Anne Houdusse, Françoise Ochsenbein, Pierre Legrand, Dietmar Manstein, Christophe Lamaze
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Françoise Ochsenbein, Chris Toseland

Mots clés

Mots clés libres

Cancer

Biologie structurale

Cible thérapeutique

Nanomoteur

Cancer

Nanomotor

Structural biology

Therapeutical target

Résumé

Les nanomoteurs des cellules Eucaryotes leur permettent d'accomplir de nombreuses tâches mécaniques complexes, nécessaires à la génération de tensions dans des emplacements cellulaires précis. Le transport ou la fixation de vésicules dans des voies d'endocytose et de sécrétion peuvent par exemple en résulter. Parmi ces moteurs, les myosines sont capables, à partir de l’hydrolyse de l’ATP, de générer de la force en association avec des filaments d'actine. Les myosines se divisent en plusieurs classes impliquées dans un large panel de fonctions et de pathologies. Leur dysfonctionnement peut entrainer de nombreuses maladies dont la spasticité, l’asthme, la cardiomyopathie, la surdité ou encore de nombreux cancers… (Coluccio, 2020).En ce sens, le projet de thèse est centré d’une part (I) sur l’étude de la régulation du moteur de myosine VI (Myo6) impliqué dans la surdité (Miyagawa et al., 2015) ainsi que de nombreux cancers (You et al., 2018 ; Yang et al., 2021 ; Yang, 2019 ; Li et al., 2015 ; Ma et al., 2015 ; Dunn et al., 2006). En effet, la Myo6 est unique parmi tous les membres de la superfamille des myosines car elle se déplace sur les filaments d'actine dans la direction opposée à toutes les autres myosines. Cette spécificité lui permet d’accomplir des rôles cellulaires uniques qui ne peuvent être effectués par aucune autre myosine. (II) D’autre part, le projet de thèse s’est concentré sur l’étude de la poche Blebbistatin (Straight et al., 2003), une poche d’inhibition au sein du domaine moteur (Roman et al., 2018) afin d’en explorer le potentiel pour le développement d’inhibiteurs spécifiques d’une isoforme de myosine.Cette thèse contribue donc :(I) à la compréhension des processus de régulation de l’activité de la Myo6 via une approche alliant biologie structurale, essais biophysiques et biologie cellulaire.Une telle régulation passe par l’existence d’un état auto-inhibé de la Myo6 (Spink et al., 2008 ; Fili et al., 2017 ; Fili et al., 2020), état dans lequel cette dernière consomme peu d’ATP et diffuse librement dans le cytosol afin que le moteur ne soit activé qu’au site requis pour son recrutement. L’étude biophysique de cet état a permis de mieux comprendre comment le stabiliser ou le déstabiliser in vitro et nous a permis d’obtenir un premier modèle de l’état auto-inhibé en utilisant la microscopie électronique. Cette étude nous a également permis de mieux comprendre le rôle différentiel des partenaires cellulaires de Myo6 pour son activation. Des mutants favorisant l’activation ou la formation de l’état auto-inhibé de la Myo6 ont été développés sur la base de cette étude. Leur capacité à être recrutés par différents partenaires de la Myo6 a ainsi pu être étudié dans des cellules de mélanome humain (MNT-1), ces essais confirment un recrutement différentiel par les partenaires et suggère recrutement non spécifique des mutant favorisant l’activation.(II) à la compréhension de la spécificité du MPH-220, un inhibiteur spécifique de la myosine-2 squelettique dérivé de l'inhibiteur de myosine bien connu, la Blebbistatin (Straight et al., 2003) à partir d'une approche cristallographique.Cette étude décrit que la spécificité de cet inhibiteur à fort potentiel pour le développement d'un nouveau traitement contre la spasticité repose sur un seul résidu non conservé dans la poche allostérique des autres myosines-2 (Gyimesi et al., 2020).

The eukaryotic cell nanomotors are able to perform many complex mechanical tasks, necessary for tension generation in precise cellular locations such as transport or attachment of vesicles in the endocytic and secretory pathways. Among these motors, myosins are able, from the hydrolysis of ATP, to generate force in association with actin filaments. Myosins are divided into many classes involved in a wide range of functions and pathologies. Their dysfunction can lead to many diseases including spasticity, asthma, cardiomyopathy, deafness or many cancers... (Coluccio, 2020).Thus, the thesis project is centered on the one hand (I) on the study of the regulation of myosin VI (Myo6) involved in deafness (Miyagawa et al., 2015) as well as many cancers (You et al., 2018; Yang et al., 2021; Yang, 2019; Li et al., 2015; Ma et al., 2015; Dunn et al., 2006). Myo6 is unique among all members of the myosin superfamily because it moves on actin filaments in the opposite direction to all other myosins. (II) On the other hand, the thesis project focused on the study of the Blebbistatin pocket (Straight et al., 2003), an inhibitor pocket within the myosin motor domain (Roman et al., 2018) in order to explore its potential for the development of specific inhibitors of a myosin isoform. This specificity allows it to perform unique cellular roles that cannot be performed by any other myosin. This thesis therefore contributes to:(I) Understanding the processes regulating the activity of Myo6 via an approach combining structural biology, biophysical tests and cell biology.Such regulation involves the existence of an auto-inhibited state of Myo6 (Spink et al., 2008; Fili et al., 2017; Fili et al., 2020), a state in which the latter consumes little ATP and diffuses freely into the cytosol so that the motor is activated only at the site required for its recruitment. The biophysical study of this state has made it possible to better understand how to stabilize or destabilize it in vitro and has enabled us to obtain a first model of the auto-inhibited state using negative staining electron microscopy. This study also allowed us to better understand the differential role of cellular partners of Myo6 for its activation. Mutants promoting the activation or formation of the auto-inhibited state of Myo6 have been developed based on this study. Their ability to be recruited by different partners of Myo6 could thus be studied in human melanoma cells (MNT-1), these tests confirm a differential recruitment by the partners and suggest non-specific recruitment of mutants promoting activation.(II) Understanding the specificity of the MPH-220, a specific inhibitor of skeletal Myosin-2 derived from the well-known myosin inhibitor, Blebbistatin (Straight et al., 2003) from a crystallographic approach.This study describes that the specificity of this inhibitor with high potential for the development of new treatment against spasticity is based on a single non-conserved residue in the Blebbistatin allosteric pocket of the other myosins-2 (Gyimesi et al., 2020).