Dynamique de Rad51 lors de la recombinaison homologue chez la levure vivante

Dynamics of Rad51 during homologous recombination in living yeast

• Auteur / Autrice : Siyu Liu
• Direction : Angela Taddei, Judith Miné-Hattab
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et développement
• Date : Soutenance le 30/11/2022
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie (Paris ; 1978-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Dynamique du noyau [Institut Curie]
• Jury : Président / Présidente : Olivier Espéli
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Angela Taddei, Judith Miné-Hattab, Eric Coïc, Josée Guirouilh-Barbat, Pauline Dupaigne
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Eric Coïc, Josée Guirouilh-Barbat

Mots clés

Mots clés libres

Rad51

Protéine recombinase

Super résolution

Rad51

Recombinase protein

Super resolution

Résumé

L'ADN est le principal vecteur d'information génétique et son intégrité est vitale pour la survie des cellules. Pourtant, l'ADN est sous la pression des dommages causés par des facteurs exogènes et endogènes. Les cassures double brin (CDB) sont parmi les dommages les plus toxiques puisqu’une CDB non réparée peut être léthale. Les cellules ont développé plusieurs voies pour réparer les CDB, dont la jonction d'extrémités non homologues (NHEJ) et la recombinaison homologue (RH). RH est une voie de réparation fidèle qui utilise une séquence homologue intacte comme modèle pour réparer les dommages. Cela implique d'identifier la séquence homologue parmi les mégabases du génome et dans le volume nucléaire des cellules eucaryotes. Au niveau moléculaire, la recherche d’homologie de l'ADN et l'invasion de l’ADN double brin homologue sont réalisées par un filament nucléoprotéique (NPF), formé par la recombinase, RecA chez les bactéries et Rad51 chez les eucaryotes, associée à l'ADN simple brin flanquant la CDB. Ce mécanisme a été largement étudié in vitro et in vivo par des approches génétiques et moléculaires au niveau des populations cellulaires, mais sa dynamique n'a pas pu être étudiée dans les cellules vivantes faute de version fluorescente fonctionnelle de Rad51. Ainsi, comment l'ADN brisé peut-il trouver une séquence homologue dans le volume du noyau et parmi les mégabases d'ADN reste mystérieux.Sur la base d’études structurales, en collaboration avec Raphael Guerois (I2BC, CEA, France), nous avons développé et caractérisé la première version fonctionnelle étiquetée d'une recombinase chez la levure S. cerevisiae.Suite à l'induction de DSB unique, nous observons pour la première fois dans des cellules vivantes, Rad51 formant des filaments pouvant atteindre un ou deux microns de longueur et traverser le volume du noyau pour contacter une séquence homologue. Comme prédit par des études génétiques et des données obtenues in vitro, leur formation nécessite le chargeur de recombinase Rad52 et la formation d'un long fragment d'ADNsb. De plus, les filaments Rad51 adoptent une variété de formes qui sont modulées par des facteurs auxiliaires de Rad51, apportant un nouvel éclairage sur la fonction de ces facteurs dans les cellules vivantes.Contrairement à ce qui a été rapporté pour les filaments RecA chez les bactéries, les filaments Rad51 montrent un comportement étonnamment dynamique : avec de fréquents événements de compaction suivis d’une ré-extension offrant des opportunités pour le filament d'être projeté dans une zone nucléaire différente, et ainsi d'explorer de nouvelles régions génomiques. La modélisation biophysique du processus de recherche d'homologie par notre collaborateur Leonid Mirny (MIT, USA) révèle que ces cycles de compaction/extension constituent une stratégie très robuste pour qu'une identité unique trouve sa cible dans l'espace nucléaire.

DNA is the major carrier of genetic information in prokaryotic and eukaryotic cells and its integrity is vital for the survival of cells. However, DNA is under pressure of damages caused by both exogenous and endogenous factors. Double strand break (DSB) is one of the most toxic DNA damages and even one unrepaired DSB is lethal to cells. Cells have evolved several pathways to repair DSBs, including non-homologous end joining (NHEJ), and homologous recombination (HR). HR is an error free repair pathway that uses an intact homologous sequence as a template to repair the damage. This involves identifying the homologous sequence among the mega bases of the genome and in the nuclear volume of eukaryotic cells. At the molecular level, DNA sampling and strand invasion of the homologous dsDNA is achieved by a nucleoprotein filament (NPF), formed by the recombinase, RecA in bacteria and Rad51 in eukaryotes, coating ssDNA. This mechanism has been extensively studied in vitro and in vivo through genetic and molecular approaches at the level of cell populations, but its dynamics could not be studied in living cells due to lack of functional fluorescent version of Rad51. Thus, how broken DNA can find a homologous sequence in the volume of the nucleus and among the megabases of DNA remains mysterious.Thanks to structural insights from our collaborator Raphael Guerois (I2BC, CEA, France), we developed and characterized the first functional, internally tagged version of a recombinase in the yeast S. cerevisiae. Following the induction of unique DSB, we observe for the first time in living cells, Rad51 forming micrometer long filaments spanning across the whole nucleus and contacting the donor sequence. As predicted from genetic and in vitro data, their formation requires the recombinase loader Rad52 and the formation of long stretch of ssDNA. Furthermore, emerging filaments adopt a variety of shapes, not reported in vitro and modulated by Rad51 ancillary factors, shedding new light on the function of these factors in living cells.In contrast to what has been reported for RecA filaments in bacteria, Rad51 filaments show a surprisingly dynamic behavior: with frequent compaction events followed by re-extension providing opportunities for the NPF to be projected into a different nuclear area, and thus explore new genomic regions. Biophysical modeling of the homology search process by our collaborator Leonid Mirny (MIT, USA) reveals that these cycles of compaction/extension constitute a very robust strategy for a unique identity to find its target in the nuclear space.