Identification de nouveaux régulateurs moléculaires de la différenciation des monocytes humains

Identifying novel molecular regulators of human monocyte differentiation

• Auteur / Autrice : Javiera Villar Leal
• Direction : Elodie Segura
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 07/07/2022
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Immunité et cancer (Paris ; 2009) - Immunité et cancer
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie (Paris ; 1978-....)
• Jury : Président / Présidente : Sandrine Henri
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Elodie Segura, Mélanie Greter, Carlos Ardavin, Leïla Perié, Charles-Antoine Dutertre
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Mélanie Greter, Carlos Ardavin

Mots clés

Mots clés libres

Monocyte

Différenciation

Etv3; etv6

Mo-Mac

Mo-DC

Inflammation

Monocyte

Differentiation

Etv3; etv6

Mo-Mac

Mo-DC

Inflammation

Résumé

Les monocytes circulent dans le sang et sont recrutés dans les tissus où ils se différencient en macrophages (mo-mac) ou cellules dendritiques (mo-DC). Les mo-DC et les mo-mac participent respectivement à l'initiation et à la résolution des réponses immunitaires inflammatoires. Cependant, dans les maladies chroniques inflammatoires, les mo-DC ont des effets délétères en entretenant le cycle de l’inflammation. Ainsi, manipuler la différenciation des monocytes pourrait contribuer à restaurer l'homéostasie tissulaire. Un obstacle majeur à cette stratégie est notre connaissance limitée des mécanismes moléculaires mis en jeu. L'objectif de ma thèse est d'identifier de nouveaux régulateurs de la différenciation des monocytes en utilisant deux approches complémentaires :(1) une approche basée sur des candidats, s’appuyant sur les travaux antérieurs du groupe. Une analyse transcriptomique comparative a révélé plusieurs facteurs de transcription différentiellement exprimés entre mo-DC et mo-mac. Dans ce projet, je me suis concentrée sur ETV3 et ETV6, des répresseurs transcriptionnels qui sont fortement exprimés dans les mo-DCs. Leur rôle dans la différenciation des monocytes était inconnu.(2) une approche non biaisée utilisant l'analyse RNAseq de cellules uniques. Les voies moléculaires de la différenciation des monocytes humains sont fréquemment analysées à partir de cellules déjà différenciées, soit mo-DC ou mo-mac. Des informations essentielles pourraient être obtenues en analysant des stades plus précoces. Pour analyser la dynamique de la différenciation des monocytes, j’ai réalisé des expériences d'RNAseq unicellulaires à différents moments de la différenciation en utilisant un modèle in vitro. J’ai reconstruit ensuite les trajectoires de développement pour découvrir de nouvelles voies moléculaires qui régulent l'engagement des monocytes.En utilisant un modèle in vitro de différenciation des monocytes humains, j'ai montré que les facteurs de transcription Etv3 et Etv6 contrôlent la différenciation en moDC. Une analyse transcriptomique a révélé que Etv3 et Etv6 répriment les gènes stimulés par l'interféron. J’ai également validé ces résultats in vivo en montrant que Etv6 est impliqué dans la différenciation des mo-DC lors de l’inflammation et identifié Etv6 comme cible thérapeutique dans la sclérose en plaque.Parallèlement, j'ai analysé des monocytes en cours de différenciation en utilisant la technologie de transcriptomique en cellule unique. Par un clustering non biaisé et l’analyse d’expression différentielle des gènes, j’ai observé qu’à 3-9h de culture certains groupes de monocytes sont déjà engagés à devenir mo-DC ou mo-Mac. J'ai analysé les facteurs de transcription présentant une activité ou une expression différentielle entre les cellules engagées en mo-DC versus mo-Mac. J'ai validé que IRF1 module la différenciation en mo-mac, et ZNF366, MAFF et ETS2 en mo-DC. Ces analyses ont révélé de nouvelles voies de signalisation et facteurs de transcription impliqués dans le processus d’engagement des monocytesMes résultats contribuent à mieux comprendre les mécanismes moléculaires régulant le destin cellulaire des monocytes.Mots-clés : Monocytes, différenciation, mo-mac, mo-DC, Inflammation, ETV3, ETV6

Monocytes and monocyte-derived cells are central players in the initiation and resolution of inflammatory responses. In chronic inflammatory diseases, monocyte-derived antigen-presenting cells become major drivers of the physiopathology by stimulating pathogenic T cells. Blocking monocyte differentiation therefore represents an attractive therapeutic strategy. A major hurdle is the paucity of molecular targets, due to a limited knowledge of the molecular regulation of monocyte fate commitment. The objective of my thesis is to identify new regulators of monocyte differentiation using two complementary approaches:(1) a candidate-based approach, built on previous work of the group. Comparative transcriptomic analysis revealed several transcription factors differentially expressed between mo-DC and mo-mac. In this project, I focused on ETV3 and ETV6, transcriptional repressors that are highly expressed in mo-DCs. Their role in monocyte differentiation was unknown.(2) an unbiased approach using single-cell-RNAseq analysis. The molecular pathways of human monocyte differentiation are frequently analyzed from already differentiated cells, either mo-DCs or mo-mac. To analyze the dynamics of monocyte differentiation at earlier stages, I performed scRNAseq experiments at different time points using an in vitro model of differentiation. I then reconstructed the developmental trajectories to discover new molecular pathways that regulate monocyte commitment.Here we show that the transcriptional repressors ETV3 and ETV6 control human monocyte differentiation into mo-DC. Mechanistically, we find that ETV3 and ETV6 repress mo-Mac development and inhibit the expression of interferon-stimulated genes. Mice deficient for ETV6 in monocytes showed spontaneous expression of interferon-stimulated genes, confirming that ETV6 regulates interferon responses in vivo. Furthermore, these mice display impaired mo-DC differentiation during peritonitis and ameliorated experimental autoimmune encephalomyelitis.In parallel, I analyzed differentiating monocytes using single cell transcriptomics technology. By unbiased clustering and differential gene expression analysis, I observed that at 3-9h of culture some groups of monocytes are already committed to become mo-DC or mo-Mac. I analyzed the transcription factors showing differential activity or expression between cells committed to mo-DC versus mo-Mac. I validated that IRF1 modulates differentiation into mo-mac, and ZNF366, MAFF and ETS2 into mo-DC. These analyses revealed new signalling pathways and transcription factors involved in the monocyte commitment process.My results contribute to a better understanding of the molecular mechanisms regulating monocyte fate.Key Words: Monocyte, Human, Differentiation, mo-mac, mo-DC, Inflammation, ETV3, ETV6