Etude des éléments clefs nécessaires à la création d'un muscle squelettique 3D biomimétique et vascularisé sur puce microfluidique

Deciphering the key conditions required to build a 3D biomimetic vascularized and innervated skeletal muscle-on-chip

• Auteur / Autrice : Manh-Louis Nguyen
• Direction : Stéphanie Descroix
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie Physique
• Date : Soutenance le 15/03/2022
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Chimie physique et chimie analytique de Paris Centre (Paris ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Physique des Cellules et Cancer (Paris ; 2024-....) - Laboratoire Physico-Chimie Curie [Institut Curie]
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie (Paris ; 1978-....)
• Jury : Président / Présidente : Danijela Vignjevic
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Stéphanie Descroix, Cécile Legallais, Xavier Gidrol, Olivier Benveniste, Laurent Malaquin, Edgar Gomes
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Cécile Legallais, Xavier Gidrol

Mots clés

Mots clés libres

Organe sur puce

Microfluidique

Ingénierie tissulaire

Myopathies

Vascularisation

Microfabrication

Organ on chip

Microfluidics

Tissue engineering

Myopathies

Vascularization

Microfabrication

Résumé

L’essor de la microfluidique en biologie a conduit la communauté scientifique à développer des modèles in vitro de différents organes, initiant ainsi le domaine des organes sur puce. Ceux-ci ont but d’apporter un modèle biomimétique complémentaire aux systèmes traditionnels, avec une transposition plus fiable des résultats chez l’Homme. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés au muscle squelettique. Le muscle squelettique in vivo se compose de longues cellules musculaires, alignées dans l’axe longitudinal du muscle, regroupées en fascicules. Plusieurs fascicules forment le muscle. La matrice extracellulaire (MEC) principalement composée de collagène I segmente ces parties et abrite d’autres types cellulaires. Reproduire un muscle squelettique in vitro requiert donc un pré alignement des cellules dans un hydrogel bio compatible. L’objectif était de déterminer les éléments clefs nécessaires à la génération d’un tissu musculaire squelettique biomimétique en système microfluidique tubulaire.Nous avons donc développé une puce microfluidique, composée de tubes parallèles et indépendants en collagène I. Pour des tubes en collagène de 200 µm de diamètre, l’ensemencement des cellules C2C12 suspendues dans du milieu de culture ne permettait pas de reproduire l’architecture du muscle, les cellules musculaires s’organisant sous forme de lumen. Afin de modifier l’auto-organisation cellulaire, nous avons évalué l’effet d’un ensemencement en présence de MEC permettant une adhésion des cellules dans toute la section du tube, mais aussi une approche d’ensemencement séquentiel permettant aux cellules de reposer sur un matériau de rigidité appropriée. Bien que cette dernière approche permettait un meilleur alignement des myotubes, l’organisation en lumen persistait pour ces deux conditions.Puis nous avons évalué l’effet d’un substrat de courbure trois fois supérieure (75 µm de diamètre) sur l’organisation cellulaire. Dans ce cas, les cellules colonisaient l’intégralité du volume disponible du tube en collagène. Comme précédemment, différentes conditions d’ensemencement ont été évaluées. Nos résultats ont montré ici que les cellules ensemencées dans du milieu de culture permettaient un meilleur alignement des myotubes le long de l’axe, un meilleur alignement des noyaux parallèles aux myotubes, la formation de myotubes striés, ainsi qu’une augmentation des gènes de différentiation musculaire. En revanche, les cellules ensemencées en présence de MEC généraient des myotubes ramifiés d’aspect hétérogène, avec un indicateur de fusion cellulaire et un diamètre moyen significativement plus grands. Ces caractéristiques sont retrouvées dans certaines myopathies.En parallèle, nous avons montré la versatilité de notre système en développant un vaisseau sur puce de 200 µm de diamètre en utilisant des cellules primaires endothéliales humaines, l’objectif étant de reproduire l’écosystème musculaire et notamment les autres types cellulaires. L’intégrité morphologique et fonctionnelle de ce vaisseau sur puce a été caractérisée par immunomarquage des jonctions adhérentes, par des études de perméabilité vasculaire, d’adhésion leucocytaire et de biologie moléculaire par RT-qPCR. Cependant, les premiers essais de co-culture avec les C2C12 se sont heurtés à une incompatibilité des milieux de cultures. Nous avons également mis en œuvre la co-culture des C2C12 avec la lignée fibroblastique NIH 3T3 permettant la génération de myotubes ayant la même maturation sur le plan morphologique, que ceux générés précédemment en mono culture dans les tubes en collagène de 75 µm. Néanmoins, la co-culture permettait une meilleure maturation sur le plan moléculaire, avec une expression augmentée des gènes de différentiation musculaire.Les perspectives à venir seront d’y cultiver des cellules primaires/souches induites, permettant de créer des modèles de pathologies et d’étudier l’influence sur le tissu musculaire de traitements perfusés dans le vaisseau sur puce.

Advances in microfluidics and especially in biology prompted scientists to develop in vitro organs models, thus initiating the organ-on-chip technology. The aim is to bring complementary biomimetic models to traditional ones with results more faithfully transposable to Human. We were particularly interested in the skeletal muscle. In vivo skeletal muscle is made of long muscle cells, aligned parallel to the longitudinal axis, gathered into fascicles. Several fascicules constitute the whole muscle. Extracellular matrix (ECM), mainly composed of collagen I, compartmentalizes those structures and hosts many other cell types. Recapitulating a skeletal muscle in vitro therefore required cell pre alignment, embedded in a bio compatible hydrogel. The objective was to determine the key cues required to generate a biomimetic skeletal muscle in a tubular system.We developed a microfluidic chip, composed of independent and parallel collagen I hollow tubes. Within 200 µm diameter collagen tubes, seeding C2C12 cells in growth medium did not faithfully recapitulate the skeletal muscle architecture, cells organizing into in a lumen structure. To modify muscle cells self-organization, we investigated the effect of cell seeding in the presence of ECM, allowing cells to adhere through the whole collagen tube section, as well as a sequential seeding approach, giving to cells an appropriate substrate stiffness. The lumen organization still remained when seeding cells mixed with ECM or for sequential seeding. However, this latest seeding condition resulted in a higher myotubes alignment toward the long axis of the collagen tube.We then evaluated the effect of a substrate with 3-folds higher curvature (tube of 75 µm) on cell self-organization. In this case, muscle cells colonized the whole available volume of the collagen tube. Seeding cells suspended in growth medium resulted in a better cell organization with higher aligned myotubes toward the long axis, a better nuclei alignment parallel to the myotubes, the formation of striated myotubes, and an upregulation of muscle differentiation genes. On the other hand, cells mixed with ECM generated branched and heterogeneous myotubes, with larger diameter and higher fusion indicator. This is similar to what we find in some myopathies.In parallel, we demonstrated the versatility of our system by generating a micro vessel-on-chip of 200 µm diameter using human primary endothelial cells, the objective being to recapitulate the skeletal muscle ecosystem and the other cell types. Investigations by immunostaining of adherent junction (VE-cadherin), vascular permeability, leukocytes adhesion and molecular biology with RT-qPCR showed the morphological and functional integrity of the vessel-on-chip. However, the first results of co-culture with C2C12 cells encountered medium incompatibility, leading to a high cell death. We also performed co-cultures of C2C12 with NIH 3T3 fibroblast cell line, allowing the generation of myotubes with the same morphological maturation as the one generated previously in mono culture within 75 µm collagen tubes. However, this co-culture allowed a better myotubes maturation on a molecular point of view, with an upregulation of the muscle differentiation genes.This micro device is promising and future perspectives include cultivating primary cells or induced pluripotent stem cells. This would allow us to create diseases models and to study the impact of perfused drugs through the vessel, on the muscle-construct.