Développement d'un dispositif microfluidique permettant l'étude de la viscosité de solutions de protéines concentrées, sur une large gamme de concentration

Development of a microfluidic platform allowing viscous characterization of concentrated protein solutions over an extended concentration range

• Auteur / Autrice : Paul Cochard-Marchewka
• Direction : Jean Baudry
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie Physique
• Date : Soutenance le 14/03/2022
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Chimie physique et chimie analytique de Paris Centre (Paris ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de biochimie (Paris ; 2014-.... ; équipe interne) - Laboratoire Colloïdes et Matériaux Divisés
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Ecole supérieure de physique et de chimie industrielles de la Ville de Paris (1882-....)
• Jury : Président / Présidente : Anke Lindner
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean Baudry, Cécile Cottin-Bizonne, Jean-Baptiste Salmon
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Cécile Cottin-Bizonne, Jean-Baptiste Salmon

Mots clés

Mots clés libres

Anticorps Monoclonaux

Protéines

Viscosité

Microfluidique

Gouttes

Monoclonal Antibodies

Proteins

Viscosity

Microfluidics

Droplets

Résumé

La microfluidique en gouttes permet l’étude d’échantillons individuels dans des volumes de l’ordre du nanolitre. Les possibilités de parallélisation et de suivi individuel offertes par la manipulation de micro-gouttes ont été exploitées dans de nombreux domaines, tels que l’étude de cellules uniques par exemple.Parallèlement, un effort de recherche grandissant cherche à permettre la caractérisation de solutions de protéines hautement concentrées, pour mieux comprendre les effets d’encombrement macromoléculaire par exemple, ou pour cribler le comportement visqueux de protéines thérapeutiques dans diverses conditions. La rareté et le coût des solutions de protéines restreint le plus souvent la faisabilité de ces études expérimentales, motivant le développement de techniques de caractérisation à faible volume.Nous avons conçu un dispositif microfluidique permettant la rhéologie de protéines et plus généralement de tout composé soluble dans l’eau. L’élément central de ce dispositif est une puce microfluidique permettant la production in-situ, la sélection et le suivi de gouttes individuelles.Le rétrécissement des gouttes entraîne la concentration du soluté au sein de la puce, jusqu’à un facteur 400.Pendant le processus de concentration, la viscosité au sein des gouttes est mesurée continuellement sur une large gamme accessible (1-1000 mPa.s). Ainsi, la caractérisation rhéologique complète de biopharmaceutiques est réalisable en une seule expérience, avec une consommation limitée à 1 µL de solution diluée.Le manuscrit commence par une introduction à la rhéologie des protéines et à la microfluidique.L’architecture et le fonctionnement de la puce sont ensuite détaillés. Sont notamment présentés le choix d’un émulsificateur à gradient de confinement et la réduction de volume consommé qui en découle, ainsi que le phénomène de pervaporation de l’eau permettant le rétrécissement des gouttes et la concentration des solutés. Les contraintes techniques participant à ces choix sont également discutées.Les processus permettant le suivi de la concentration et la microrhéologie par suivi vidéo de particules sont ensuite présentés. Pour chaque étape, une estimation systématique de l’erreur de mesure est réalisée, aboutissant à une estimation de la précision globale du système.Plusieurs expériences de validation ont été réalisées, étudiant des solutés au comportement visqueux connu comme le sucrose ou des protéines globulaires modèles comme l’albumine de sérum bovin ou le lysozyme. Leurs résultats sont présentés, permettant la démonstration des capacités expérimentales de notre dispositif et la discussion de ses limites.Après une conclusion synthétisant l’ensemble de ces travaux et ouvrant de nouvelles perspectives, des informations techniques et des données additionnelles sont regroupées en annexe.

Droplet-based microfluidics allow the study of individual samples in nanoliter-sized compartments. The possibilities offered by the manipulation of droplets have been exploited in many fields such as single-cell biology, requiring massive parallelization and individual tracking.Moreover, there is a growing interest in studying protein samples at high concentrations to better understand the effect of macromolecular crowding, or to screen the viscosity of biopharmaceuticals under various conditions. In many cases, the scarcity and cost of such proteins limit or prohibit the use of standard rheological techniques. As such, there is a pressing need to lower the required sample volumeWe have designed a specific microsystem for investigating viscous features of various hydrophilic compounds. Our experimental strategy, combining microfluidics and emulsion droplets, allows in-situ production, selection and monitoring of water droplets in a PDMS chip.Droplet shrinking causes in-chip solute concentration by a factor of 400. During the concentration process, rheological study of the sample is made possible by continuous viscosity measurements in the range of 1-1000 mPa.s, allowing full characterization of biopharmaceuticals in just one experiment and requiring as low as 1 µL of dilute solution.After introducing the fields of high-concentration protein rheology and microfluidics, this manuscript presents the design and operating ways of our chip. More specifically, the minimization of required volume through the choice of step-dropmaking is detailed, as well as the use of pervaporation-induced shrinking for solute concentration, with discussion on the technical challenges posed by those choices.Subsequently, both the concentration monitoring and multi-particle tracking microrheology techniques are introduced, with a particular interest in quantitative error estimation at each step to evaluate the global precision of the system.Various validation experiments have been conducted, using calibrated samples such as sucrose or model globular proteins such as bovine serum albumin or lysozyme. Their results are used to showcase the capabilities of our experimental system and discuss its limits.After a conclusion summarizing the aforementioned work and opening new perspectives, an appendix gathers technical information and additional data such as detailed experimental protocols.