Étude structurale et fonctionnelle de DciA, le partenaire ancestral de l'hélicase réplicative bactérienne DnaB

Structural and functional study of DciA, the ancestral partner of the bacterial replicative helicase DnaB

• Auteur / Autrice : Claire Cargemel
• Direction : Sophie Quevillon-Cheruel, Stéphanie Marsin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie structurale
• Date : Soutenance le 15/12/2022
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie intégrative de la cellule (Gif-Sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université Paris-Saclay. Faculté de pharmacie (Orsay, Essonne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Agathe Urvoas
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Amédée Des Georges, Marc Boudvillain, Zaineb Fourati-Kammoun, François Lecointe
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Amédée Des Georges, Marc Boudvillain

Mots clés

Mots clés contrôlés

Radiocristallographie

ADN -- Réplication

Hélicases

Mots clés libres

Hélicase réplicative

Réplication

Complexes

DciA

Biologie structurale

Macromoléculaires

Replicative helicase

DNA replication

Macromolecular complexes

DciA

Structural biology

Résumé

La réplication de l'ADN génomique est une étape essentielle dans la division des organismes. Deux complexes multi-protéiques nommés réplisomes parcourent le chromosome de manière bidirectionnelle pour dupliquer l'ADN. En amont du réplisome, l'hélicase réplicative est en charge du désappariement de l'ADN double brin, rendant accessible l'ADN simple brin à l'ADN polymérase. Chez les bactéries, la protéine d'initiation DnaA ouvre localement le site d'initiation oriC, favorisant le recrutement sur les deux brins d'ADN de deux hélicases DnaB. Chez le modèle Escherichia coli, le positionnement de DnaB sur l'ADN dépend du facteur de chargement DnaC, qui applique une torsion sur l'anneau de l'hélicase, aboutissant à son ouverture et l'amenant ainsi à adopter une conformation structurale active pour le chargement sur l'ADN. Cependant, la distribution de DnaC est marginale dans le domaine bactérien. Il a été établi phylogénétiquement que le gène dnaC, d'origine phagique, a remplacé sept fois le gène ancestral dciA au cours de l'évolution. Une étude in vivo a permis de montrer que DciA est une protéine essentielle impliquée dans l'initiation de la réplication et qu'elle interagit avec l'hélicase DnaB.Les objectifs de cette thèse ont été de caractériser la protéine DciA chez la bactérie modèle Vibrio cholerae (VcDciA), et de mettre en évidence son implication dans le chargement de l'hélicase (VcDnaB), par des techniques biochimiques et structurales.Nos expériences de mesure de l'activité hélicase d'une part, et de chargement sur un ADN simple brin par résonnance plasmonique de surface (SPR) d'autre part, ont montré que VcDciA stimule le chargement de VcDnaB, ayant pour conséquence une augmentation de son activité de translocation et de désappariement de l'ADN. Nous avons ainsi montré que VcDciA est une protéine de chargement d'hélicase, en accord avec le rôle prédit de DciA dans l'initiation de la réplication.Nous avons mené une analyse structurale à haute résolution des différents états de l'hélicase de V. cholerae et résolu par cristallographie les structures de VcDnaB liée à un analogue de l'ATP, et en complexe avec un ADN simple brin. Ces structures montrent que de manière similaire aux autres hélicases, VcDnaB adopte une structure homo-hexamérique de forme toroïdale, mais légèrement ouverte. La structure de VcDnaB en complexe avec un oligonucléotide montre également que l'interaction avec l'ADN et le mécanisme de translocation de l'hélicase sur l'ADN sont conservés. Nous avons également identifié une nouvelle conformation de l'hélicase apo, où l'anneau C-terminal est formé par un assemblage de trois dimères, contrairement à la symétrie hexamérique observée en présence d'ATP.D'autre part, nous avons résolu la structure du domaine N-terminal de VcDciA par RMN et montré son homologie avec les domaines KH, connus pour fixer des acides nucléiques. VcDciA interagit effectivement avec l'ADN, et nous avons caractérisé son interaction avec l'ADN simple et double brin par RMN, nous permettant de désigner les acides aminés impliqués. Une analyse par SAXS a par ailleurs montré que le domaine C-terminal n'est pas structuré en solution. Nous avons résolu la structure du complexe VcDnaB•VcDciA par cristallographie et montré que le domaine C-terminal de VcDciA se structure en deux hélices α suite à son interaction avec l‘hélicase. VcDciA cible un module de VcDnaB formé par deux hélices antiparallèles provenant de deux monomères adjacents. Cette surface de l'hélicase est également ciblée par les protéines de chargement DnaC et λP dans les complexes EcDnaB•EcDnaC et EcDnaB•λP. Cependant DciA n'applique pas la torsion provoquée par EcDnaC sur l'hélicase. Le mécanisme de chargement de l'hélicase par DciA est donc probablement différent de celui décrit chez le modèle E. coli. Des expériences préliminaires clôturant ce travail de thèse permettent d'ouvrir certaines portes, qui vont permettre de le décrire lors des prochains travaux de l'équipe.

DNA replication is a crucial step in the division of organisms. Two multi-subunit complexes, called replisomes, carry out DNA duplication of the chromosome by advancing in opposite directions around the chromosome. In front of the replisome, the replicative helicase unwinds the double-stranded DNA, exposing the single-stranded DNA to the DNA polymerase. In bacteria, the initiation protein DnaA locally unwinds the initiation site named oriC. This promotes the recruitment of two DnaB helicases on each DNA strand. In the Escherichia coli model, DnaB loading on DNA depends on the loading protein DnaC, which applies a torsion on the DnaB ring, resulting in its opening. This open complex is an active conformation for the loading on DNA. However, the distribution of DnaC is marginal in the bacterial domain. It was phylogenetically established that the phage origin dnaC gene replaced the ancestral dciA gene seven times during bacterial evolution. An in vivo study showed that DciA is an essential protein involved in the replication initiation and that it interacts with the helicase DnaB.The aims of this thesis were to characterize the DciA protein in the bacterial model Vibrio cholerae (VcDciA), and to demonstrate its involvement in the loading of the helicase (VcDnaB), using biochemical and structural techniques.Our measurements on helicase activity, on the first hand, and on single-stranded DNA loading by surface plasmon resonance (SPR), on the other hand, have shown that VcDciA stimulates VcDnaB loading, increasing DnaB translocation and DNA unwinding activities. Thus, we showed that VcDciA is a helicase loading protein in agreement with the predicted role of DciA in replication initiation.We performed a structural study of the different states of the V. cholerae helicase and solved by crystallography the structures of VcDnaB in complex with an ATP analogue, and loaded on a single-stranded DNA. Like other bacterial replicative helicases, VcDnaB adopts a hexameric homo-hexameric structure with a toroidal shape, but slightly open. The structure of VcDnaB complexed with a single-stranded DNA showed that the interaction with DNA and the translocation mechanism of the helicase on DNA is conserved. We also identified a new conformation of the apo-helicase, where the C-terminal ring is formed by a trimeric assembly of three dimers, in contrast with the hexameric symmetry observed in the presence of ATP.We also solved the structure of the N-terminal domain of VcDciA by NMR and showed its homology with the KH domains, known to bind nucleic acids. VcDciA interacts with DNA, and we characterized its interaction with single and double-stranded DNA by NMR, highlighting the amino acids involved. In contrast, SAXS analysis showed that the C-terminal domain is unfolded in solution. We solved the structure of the VcDnaB•VcDciA complex by crystallography. It revealed that the C-terminal domain of VcDciA is folded into two α-helices in contact with the helicase. VcDciA targets a module of VcDnaB formed by two antiparallel helices from two adjacent monomers. This helicase surface is also targeted by the loading proteins DnaC and λP in the EcDnaB•EcDnaC and EcDnaB•λP complexes. Unlike DnaC, DciA does not apply a torsion force on the helicase. Thus, the mechanism of helicase loading by DciA is likely different from that described in the E. coli model. At the end of this thesis, preliminary experiments explore how DciA loads DnaB on single-strand DNA.