Rôle de l'axe BMP-9/ ALK1 dans l'hypertension artérielle pulmonaire : Un paradoxe à résoudre pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques

Role of BMP9/ ALK1 Pathway in Pulmonary Arterial Hypertension : In Search for New Therapeutic Targets

• Auteur / Autrice : Nihel Berrebeh
• Direction : Christophe Guignabert, Ly Tu
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physiologie et physiopathologie
• Date : Soutenance le 13/12/2022
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Hypertension pulmonaire : physiopathologie et innovation thérapeutique (2010-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université Paris-Saclay. Faculté de pharmacie (Orsay, Essonne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Marc Humbert
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Laurence Dewachter, Christelle Guibert, Carole Planès, Bernard Maitre
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Laurence Dewachter, Christelle Guibert

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules endothéliales

Remodelage vasculaire

Transduction du signal cellulaire

Protéines morphogénétiques osseuses

Physiopathologie

Hypertension artérielle pulmonaire

Mots clés libres

Remodelage vasculaire pulmonaire

Dysfonction endothéliale

Hypertension pulmonaire

Angiogénèse

Bmp

Bmp

Endothelial dysfunction

Pulmonary vascular remodeling

Angiogenesis

Pulmonary hypertension

Résumé

Les perturbations de l'axe BMP-9/ ALK1/ BMPR-II sont au cœur du développement de l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Des mutations du gène BMPR2, codant pour le récepteur BMPR-II (bone morphogenetic protein receptor type II), sont en effet les principales causes des formes familiales et héritables d'HTAP. De plus, des mutations des gènes codant pour BMP-9 et BMP-10 (respectivement, GDF2 et BMP10) et leur récepteur ALK1 ont été identifiées comme étant aussi associées à quelques rares cas d'HTAP familiales. Cependant, le rôle exact de la signalisation BMP-9/ ALK1/ BMPR-II dans le remodelage associé à l'HTAP n'a pas encore été pleinement établi, ce qui limite le développement de stratégie thérapeutique ciblée. C'est pourquoi mes travaux ont visé à mieux comprendre les mécanismes par lesquels la perte de cet axe BMP-9/ ALK1/ BMPR-II affecte la stabilité et le remodelage vasculaire in vivo et à mieux comprendre la réponse des CE pulmonaires humaines au BMP-9. OBJECTIFS : Les objectifs de mes travaux de thèse étaient de démontrer le rôle de l'axe BMP-9/ ALK1/ BMPR-II sur les balances pro- et anti-angiogéniques de CE pulmonaires et sur l'intégrité et le remodelage vasculaire pulmonaire, ainsi que sur la susceptibilité au développement de l'HTAP. MÉTHODES ET RÉSULTATS : Dans le premier axe de mon travail, les données collectées ont permis de valider que la perte de BMP-9 chez la souris, seule ou en association avec la perte de BMP-10, n'était pas associée au développement d'HTP spontanée et n'exacerbait pas non plus des HTP induites par l'hypoxie chronique. De plus, nous avons pu obtenir des preuves que la déficience en BMP-9, chez le rat, protégeait aussi partiellement contre des formes d'HTP plus sévères induites par la monocrotaline ou le sugen/hypoxie. D'autre part, nos données ont également pu révéler la présence d'anomalies vasculaires dans les poumons de rats KO Bmp9 -/-, caractérisées par une vasodilatation et une densité vasculaire plus importante de la circulation pulmonaire par rapport à des rats Bmp9 +/+. Dans le deuxième axe de recherche, nous avons étudié et précisé les mécanismes et voies moléculaires impliqués dans les actions pro-angiogéniques et vasorelaxantes du BMP-9 sur des cultures primaires de cellules endothéliales (CE) microvasculaires isolées à partir d'explants humains. A l'aide d'analyses du transcriptome en cellule unique (single cell-RNAseq), nous avons d'abord pu découvrir qu'il existait deux populations de CE pulmonaires qui exprimaient de manière plus ou moins prononcées ALK1 : CE ALK1high et ALK1low. L'étude plus approfondie de la population ALK1high a pu révéler que ces CE exprimaient de nombreux gènes qui favorisaient la capacité pro-angiogénique de ces cellules. En cohérence avec ces observations, l'ajout de BMP-9 exogène sur ces CE pulmonaires ALK1high réduisait fortement l'expression de ces gènes et atténuait leurs potentiels prolifératifs et migratoires. Ces données ont pu être validées par des études fonctionnelles dans lesquelles nous avons supprimé l'expression d'ALK1 par des approches siRNA et pharmacologiques. Enfin, ces données in vitro ont été confirmées dans les tissus pulmonaires des rats KO Bmp9 -/- et Bmp9 +/+. CONCLUSION : L'ensemble des données in vivo, in situ et in vitro démontrent l'importance jouée par l'axe BMP-9/ ALK1/ BMPR-II dans la stabilité et le pouvoir angiogénique des CE pulmonaires, deux processus qui pourraient expliquer, au moins en partie, les liens étroits qu'il existe entre cet axe et l'HTAP.

Alterations of the BMP-9/ ALK1/ BMPR-II axis plays a central role in the development and progression of pulmonary arterial hypertension (PAH). Mutations in the BMPR2 gene, encoding BMPR-II (bone morphogenetic protein receptor type II), are indeed the main causes of familial and heritable forms of PAH. In addition, mutations in the genes encoding BMP-9 and BMP-10 (respectively, GDF2 and BMP10) and their receptor ALK1 have also been identified in a few rare cases of familial PAH. However, the precise mechanisms by which the BMP-9/ ALK1/ BMPR-II axis contributes to PAH has not yet been fully established, and thereby limit the development of targeted therapeutic strategies. This is why my PhD aimed to better understand the mechanisms by which the loss of this axis affects the integrity and the remodeling of the pulmonary vasculature in vivo and to better understand the response of human pulmonary ECs to BMP-9. OBJECTIVES: The objectives of my PhD were to demonstrate the role of the BMP-9 / ALK1 / BMPR-II axis on the balance between pro- and antiangiogenic agents in pulmonary ECs, on the pulmonary vascular integrity and remodeling, and the susceptibility to PAH developpement. METHODS AND RESULTS: On one hand, we obtained evidence confirming that the loss of BMP-9 in mice, alone or in association with the loss of BMP-10, was not associated with the development of spontaneous PH and did not exacerbate PH induced by chronic hypoxia. In addition, we demonstrated also that the loss of BMP-9 in rats has a partial protective effect against severe PH induced by monocrotaline or sugen/hypoxia. Furthermore, our data revealed the presence of vascular abnormalities in the lungs of Bmp9 -/- KO rats, as reflected by marked vasodilation and increased vascular density of the pulmonary circulation than in Bmp9+/+ rats. On the other hand, we have studied and clarified the mechanisms and molecular pathways underlying the pro-angiogenic and vasorelaxant actions of BMP-9 in human pulmonary microvascular endothelial cells (ECs). Using single-cell RNA sequencing (scRNA-seq), we identified two populations of pulmonary ECs with different expression levels of ALK1: ALK1high and ALK1low. We found that ALK1high ECs exhibit a strong pro-angiogenic signature as compared with ALK1low. Consistent with these observations, the addition of exogenous BMP-9 on ALK1high ECs strongly reduced this signature, as reflected by the marked reduction in both the pro-proliferative and migratory capacities. In separate sets of experiments, pulmonary ECs were subjected to ALK1 gene silencing by using small interfering RNAs and to pharmacological agents. Finally, these in vitro observations were replicated in vivo in Bmp-9 -/- and Bmp9 +/+ KO rats. CONCLUSION: Our in vivo, in situ and in vitro findings demonstrate the central role played by the BMP-9/ ALK1/ BMPR-II axis in the pulmonary vascular integrity and the pro-angiogenic potential of human pulmonary ECs, two processes that might explain, at least in part, the interplay between this axis and PAH.