Potentiel des hépatocytes différenciés d'iPSC humaines comme alternative aux hépatocytes humains primaires pour le foie bioartificiel

Potential of human iPSC-derived hepatocytes as alternative to primary human hepatocytes for bioartificial Liver

• Auteur / Autrice : Marwa Hussein
• Direction : Anne Dubart-Kupperschmitt, Cécile Legallais
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physiologie, physiopathologie
• Date : Soutenance le 01/07/2022
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Physiopathogenèse et traitement des maladies du foie (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université Paris-Saclay. Faculté de pharmacie (Orsay, Essonne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Anne Corlu
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Anne Dubart-Kupperschmitt, Cécile Legallais, Martine Daujat-Chavanieu, Emmanuel Guedon, Didier Samuel
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Martine Daujat-Chavanieu, Emmanuel Guedon

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules souches pluripotentes induites

Pharmacie -- Recherche

Foie

Hépatocytes

Mots clés libres

Foie

Cellules souches pluripotentes induites humaines

Hepatocytes

Différenciation hépatocytaire

Culture 3D

Encapsulation

Liver

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)

Hepatocytes

Hepatic differentiation

3D culture

Encapsulation

Résumé

Pour faire face à la pénurie de foies transplantables, des dispositifs extracorporels connus sous le nom de foie bioartificiel (BAL) ont été développés. Ces dispositifs nécessitent une importante biomasse hépatique fonctionnelle, sous une forme qui maintient la viabilité et les fonctions cellulaires. Les hépatocytes primaires humains (PHH) sont considérés comme la source cellulaire idéale. Néanmoins, la disponibilité de ces cellules est restreinte et elles perdent rapidement leur fonctionnalité in vitro, ce qui limite fortement leur utilisation. Dans ce contexte, les cellules souches pluripotentes humaines induites (hiPSC) représentent une alternative prometteuse pour l'ingénierie tissulaire et la médecine régénératrice, grâce à leur capacité d'auto-renouvèlement et leur potentiel de différentiation en tout type de cellule, y compris les hépatocytes.Le projet de la thèse était d'évaluer le potentiel des hépatocytes différenciés à partir d'hiPSC (iHep) comme alternative aux PHH dans le BAL conçu au laboratoire de Biomécanique et Bioingénierie de l'UTC (BMBI- UMR CNRS 7338). A cette fin, au sein du laboratoire UMR_S1193 (INSERM - Université Paris-Saclay), nous avons optimisé les conditions de culture et d'encapsulation des iHep dans le but de produire des hépatocytes matures et pleinement fonctionnels. En effet, dans le BAL, un bioréacteur permet la perfusion des hépatocytes encapsulés en billes d'alginate pour les protéger des forces de cisaillement.Dans un premier temps, les hiPSC ont été différenciées en hépatoblastes (iHB), progéniteurs des hépatocytes qui ont été encapsulés en billes d'alginate pour la suite de la différenciation en hépatocytes. Cette démarche visait à combiner le protocole précédemment mis en place dans le BAL avec des cellules HepaRG et celui de la différenciation des hiPSC en hépatocytes. Toutefois, encapsulés en tant que cellules isolées et à faible densité, les iHB ne sont pas capables de s'auto-agréger dans les billes. Encapsulés en utilisant des densités cellulaires plus élevées, les iHB forment des agrégats, mais ils s'échappent des billes d'alginate et la différenciation des cellules n'y est plus contrôlée.Dans un deuxième temps, nous avons favorisé l'auto-agrégation des iHB en micropuits avant de les encapsuler dans l'alginate. Nos données ont démontré que l'encapsulation des agrégats préformés n'affectait ni la viabilité cellulaire ni la différenciation en hépatocytes. L'analyse des fonctions hépatocytaires des agrégats encapsulés (synthèse de l'albumine, détoxification du lactate et de l'ammoniaque, biotransformation enzymatique) a montré un niveau bien supérieur à celui des iHep cultivés en 2D (système utilisé comme contrôle) et très proche de celui des agrégats non encapsulés.Finalement, nous avons mis au point un nouveau système de production des agrégats iHB sous agitation orbitale continue en vue de la production à grande échelle des iHep. Ces agrégats, encapsulés et différenciés en iHep suivant le protocole établi précédemment, ont montré les mêmes fonctions hépatocytaires que ceux obtenus par la technique des micropuits.Ce travail démontre le potentiel d'utilisation des iHep comme source cellulaire renouvelable d'hépatocytes humains et en particulier comme composant biologique du BAL avec des protocoles d'agrégation et d'encapsulation qui sont simples à mettre en œuvre et à changer d'échelle, pour produire une biomasse suffisante à la suppléance hépatique.

To deal with the shortage of transplantable livers, extracorporeal devices known as bioartificial livers (BAL) have been developed. These devices require a large functional liver biomass, in a form that maintains cell viability and function. Primary human hepatocytes (PHHs) are considered the ideal cell source. However, the availability of these cells is limited and they rapidly lose their functionality in vitro, which strongly limits their use. In this context, human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent a promising alternative cell source for tissue engineering and regenerative medicine, thanks to their self-renewal capacity and their potential to differentiate into any cell type, including hepatocytes.The project of the thesis was to evaluate the potential of hepatocytes differentiated from hiPSCs (iHeps) as an alternative to PHHs in the BAL designed at the Biomechanics and Bioengineering laboratory of the UTC (BMBI- UMR CNRS 7338). To this end, within the UMR_S1193 laboratory (INSERM - Université Paris-Saclay), we have optimised the culture and encapsulation conditions of iHeps in order to produce mature and fully functional hepatocytes. Indeed, in the BAL, a bioreactor allows the perfusion of hepatocytes encapsulated in alginate beads to protect them from shear forces.In a first step, hiPSCs were differentiated into hepatoblasts (iHBs), hepatocyte progenitors, that were encapsulated in alginate beads for further differentiation into hepatocytes. This approach aimed to combine the protocol previously implemented in BAL with HepaRG cells and that of differentiation of hiPSCs into hepatocytes. However, encapsulated as single cells and at low density, iHBs were not able to self-aggregate in beads. Encapsulated using higher cell densities, iHBs formed aggregates, but they escaped from the alginate beads and cell differentiation was no longer controlled.In a second step, we promoted the self-aggregation of iHBs in microwells before encapsulating them in alginate. Our data showed that encapsulation of the preformed aggregates did not affect cell viability or differentiation into hepatocytes. Analysis of the hepatocyte functions of the encapsulated aggregates (albumin synthesis, lactate and ammonia detoxification, enzymatic biotransformation) showed a level well above that of iHeps grown in 2D and very close to that of the non-encapsulated aggregates (the systems used as controls).Finally, we developed a new system for the production of iHB aggregates under continuous orbital agitation for the large-scale production of iHeps. These aggregates, encapsulated and differentiated into iHeps following the previously established protocol, showed the same hepatocyte functions as those obtained by the microwell system.This work demonstrates the potential of using iHeps as a renewable cell source of human hepatocytes and in particular as a biological component of BAL using aggregation and encapsulation protocols that are simple to implement and scale up, to produce a sufficient biomass for liver replacement.