Rôle du signal calcique dans l'inflammation vasculaire : SERCA3 & TRPV4

Role of calcium signaling in vascular inflammation : SERCA3 & TRPV4

• Auteur / Autrice : Kathia Beddek
• Direction : Delphine Borgel, Régis Bobe
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physiologie, physiopathologie
• Date : Soutenance le 10/03/2022
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Hémostase, inflammation, thrombose (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Université Paris-Saclay. Faculté de pharmacie (Orsay, Essonne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Santé et médicament (2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : Association : Société française d'hématologie
• Jury : Président / Présidente : Véronique Leblais
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Christilla Bachelot-Loza, Benoît Ho-Tin-Noé, Bela Papp
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Christilla Bachelot-Loza, Benoît Ho-Tin-Noé

Mots clés

Mots clés contrôlés

Signalisation calcique

Leucocytes

Endothélium

Inflammation

Mots clés libres

Inflammation

Endothélium

Calcium

SERCA3

TRPV4

Inflammation

Endothelium

Calcium

SERCA3

TRPV4

Résumé

La signalisation calcique est fortement impliquée dans la réponse inflammatoire. En effet, plusieurs médiateurs inflammatoires (thrombine, histamine, LPS, etc.) induisent une augmentation transitoire du Ca²⁺ cytosolique via une mobilisation des réserves remplies grâce aux pompes SERCAs, et/ou une entrée du milieu extracellulaire à travers des canaux ioniques perméables au Ca²⁺ comme TRPV4. Ce Ca²⁺ libre déclenche une cascade d’activation à l’origine de nombreux effets cellulaires (réorganisation du cytosquelette, transcription génétique, sécrétion…) qui ont pour conséquence d’augmenter la perméabilité endothéliale et d’induire l’infiltration leucocytaire des tissus cibles. Si ces deux processus inflammatoires impliquant les cellules endothéliales (ECs), les leucocytes et les plaquettes, sont indispensables à la défense de l’organisme, ils sont également mis en cause dans de nombreuses pathologies associées à une dysfonction endothéliale et une réponse inflammatoire démesurée comme le sepsis ou encore la Covid-19 dont l’une des stratégies de traitement est l’immunomodulation de l’inflammation. Au vu du lien entre l’inflammation et le Ca²⁺, nous nous sommes intéressés à la pompe SERCA3 exprimée à la fois dans les ECs, les leucocytes ainsi que les plaquettes chez qui l’absence de SERCA3 est associée à une diminution de l’activation. Notre étude montre que les interactions des leucocytes avec l’endothélium sont partiellement altérées en absence de SERCA3. En effet, les souris SERCA3⁻/⁻ présentent un défaut de mobilisation précoce des leucocytes au site de la lésion endothéliale en présence ou non des plaquettes. Les phases de roulement lent et d’adhésion ferme sont également impactées. De plus le recrutement leucocytaire est diminué mais de façon dépendante des plaquettes. Pour caractériser les mécanismes à l’origine de ces observations, nous avons isolé des ECs de poumons murins (mLEC). Les mLEC SERCA3⁻/⁻ présentent une faible mobilisation calcique et une inhibition partielle de la réorganisation du cytosquelette après stimulation. Les mêmes effets sont observés dans des ECs humaines (HPAEC) traitées au tBHQ, un inhibiteur spécifique de SERCA3, avec une protection des jonctions adhérentes (VE-cadhérine) et de la barrière endothéliale. L’inhibition de SERCA3 réduit également la sécrétion et l’expression de molécules d’adhésion comme la E-sélectine et ICAM-1. En parallèle, nous avons travaillé sur le rôle de TRPV4 dans la régulation de la fonction endothéliale. Ce canal participe à de nombreuses activités cellulaires incluant l’homéostasie calcique et la régulation de la perméabilité. En étudiant des ECs artérielles (HPAEC) et veineuses (HUVEC), nous montrons que l’entrée de Ca²⁺ à travers TRPV4 induit une augmentation significative de la perméabilité via la perturbation du cytosquelette d’actine et de la VE-Cadhérine. De plus, l’activation pharmacologique de TRPV4 augmente de façon sélective l’expression d’ICAM-1 via la voie NF-κB et provoque l’apoptose et la nécrose de ces cellules. L’ensemble de ces observations peut être aboli en présence d’inhibiteurs de TRPV4 dont les effets sont même visibles en absence d’activateur suggérant un rôle de son activité basale dans la modulation de l’apoptose cellulaire. En conclusion, l’inhibition de SERCA3 et TRPV4 est associée à une amélioration de la fonction endothéliale et une inflammation modérée. Ces travaux mettent donc en évidence deux cibles potentielles dans le traitement de la dysfonction endothéliale et l’inflammation pathologique.

Calcium (Ca²⁺) signaling is strongly involved in the inflammatory response. Indeed, several inflammatory mediators (thrombin, histamine, LPS, etc.) induce a transient increase in cytosolic Ca²⁺ via a mobilization of the reserves filled thanks to the SERCAs pumps, and/or an entry of the extracellular compartment through ion channels permeable to Ca²⁺ like TRPV4. This free Ca²⁺ triggers several signaling pathways at the origin of numerous cellular effects (reorganization of the cytoskeleton, genetic transcription, secretion, etc.) which lead to increase in endothelial permeability and leukocyte infiltration. While these two inflammatory processes involving endothelial cells (ECs), leukocytes and platelets, are essential for the body's defense, they are also involved in many pathologies associated with endothelial dysfunction and an excessive inflammatory response, such as sepsis or even Covid-19. Due to the link between inflammation and Ca²⁺, we were interested in the SERCA3 pump expressed both in ECs, leukocytes as well as platelets in which the absence of SERCA3 is associated with a decrease in activation. Our study shows that the interactions of leukocytes with the endothelium are partially altered in the absence of SERCA3. Indeed, SERCA3⁻/⁻ mice exhibit a defect in early mobilization of leukocytes at the site of endothelial lesion in the presence or absence of platelets. The phases of slow rolling and firm adhesion are also impacted. In addition, leukocyte recruitment is reduced, but in a platelet-dependent manner. To characterize the mechanisms behind these observations, we isolated murine lung ECs (mLEC). SERCA3⁻/⁻ mLECs exhibit poor Ca²⁺ mobilization and partial inhibition of cytoskeletal reorganization after stimulation. The same effects are observed in human ECs (HPAEC) treated with tBHQ, a specific inhibitor of SERCA3, with protection of the adherent junctions (VE-cadherin) and the endothelial barrier. Inhibition of SERCA3 also reduces the secretion and expression of adhesion molecules such as E-selectin and ICAM-1. In parallel, we worked on the role of TRPV4 in the regulation of endothelial function. This channel participates in many cellular activities including Ca²⁺ homeostasis and the regulation of permeability. By studying arterial (HPAEC) and venous (HUVEC) ECs, we show that the entry of Ca²⁺ through TRPV4 induces a significant increase in permeability via disruption of the actin cytoskeleton and VE-Cadherin. In addition, the pharmacological activation of TRPV4 selectively increases the expression of ICAM-1 via the NF-κB pathway and causes apoptosis and necrosis in these cells. All these observations can be eliminated by the TRPV4 inhibitors. In addition, the effects of these inhibitors are even noticed in the absence of an activator, suggesting a role of TRPV4’s basal activity in the modulation of cellular apoptosis. In conclusion, inhibition of SERCA3 and TRPV4 is associated with improved endothelial function and moderate inflammation. This work therefore highlights two potential targets in the treatment of endothelial dysfunction and pathological inflammation.