Vers une caractérisation à l'échelle cellulaire et une reconstruction tridimensionnelle du noyau rétrotrapézoïde humain

Cell-scale characterization and tridimensional reconstruction of the human retrotrapezoid nucleus

• Auteur / Autrice : Jonathan Levy
• Direction : François Giuliano
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physiologie, physiopathologie
• Date : Soutenance le 24/02/2022
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Handicap neuromusculaire : physiopathologie, biothérapie et pharmacologie appliquées (Versailles ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université de Versailles-Saint-Quentin-en-Yvelines (1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Hélène Prigent
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Muriel Thoby-Brisson, Christian Straus, Gilles Fortin, Thierry Delzescaux
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Muriel Thoby-Brisson, Christian Straus

Mots clés

Mots clés contrôlés

Anatomie comparée

Hybridation in situ

Gène PHOX2B

Chémoréception

Moelle allongée

Tronc cérébral

Mots clés libres

Neuroanatomie

Physiologie respiratoire

Chémosensibilité

Noyau rétrotrapézoide

Imagerie par résonance magnétique

Imagerie fonctionnelle

Neuroanatomy

Respiratory physiology

Chemosensitivity

Retrotrapezoid nucleus

Magnetic resonance imaging

Functional imaging

Résumé

La respiration est une fonction automatique et régulée chez l'ensemble des mammifères, caractérisée par l'activité rythmique ininterrompue de l'appareil respiratoire musculo-squelettique. Elle assure de manière adaptée l'hématose, de la naissance à la mort de l'individu. Le tronc cérébral est le siège de cette fonction et de sa régulation. Elles sont extrêmement préservées au cours de l'évolution. Au sein du tronc cérébral, le noyau rétrotrapézoïde (RTN) est le siège de la chémorégulation centrale. La mutation du facteur de transcription PHOX2B est responsable d'un syndrome d'hypoventilation centrale congénitale, ou syndrome d'Ondine, caractérisé par l'absence de développement des neurones chémosensibles du RTN chez le fœtus et le nouveau-né. Déterminant essentiel de ces neurones le facteur de transcription PHOX2B, lorsqu'il est associé à d'autres marqueurs constitue une carte d'identité moléculaire des neurones chémosensibles du RTN, utilisable pour leur identification en histologie. Chez l'adulte, une dysfonction du RTN semble impliquée dans l'apparition de troubles respiratoires au cours de maladies neurodégénératives comme le Parkinson. Jusqu'alors, cette structure indispensable au contrôle central de la respiration n'a pas été décrite chez l'humain adulte.L'objectif premier de ce travail était de proposer une description anatomique à l'échelle cellulaire, des neurones chémosensibles constituant le noyau rétrotrapézoïde humain. Le second objectif était d'établir les bases nécessaires à une méthode de reconstruction tridimensionnelle de coupes histologiques, couplée à un algorithme de détection automatisée de marquages spécifiques, permettant la visualisation de structures anatomiques identifiées post mortem, au sein d'un organe modélisé à partir de coupes traitées.Une approche de neuro-anatomie comparée a été développée, basée sur l'hypothèse de la préservation de la respiration et de son contrôle au sein de plusieurs espèces de mammifères, correspondant à une organisation anatomique obéissant à des déterminants géniques et moléculaires identiques. Ainsi, le noyau rétrotrapézoïde a été décrit pour la première fois chez le primate non humain adulte, par comparaison aux descriptions faites chez le rat. Après cartographie de l'expression de PHOX2B, des neurones exprimant la pré-pro-galanine étaient retrouvés parmi les neurones PHOX2B+ en région parafaciale. Cette description chez le primate a permis de définir la région d'intérêt du tronc cérébral humain au sein de laquelle ont été identifiés des neurones exprimant la galanine et le transporteur vésiculaire de type 2 du glutamate, marqueurs spécifiques des neurones chémosensibles du noyau rétrotrapézoïde du rat adulte.Par ailleurs les travaux réalisés chez le primate, ont permis l'amélioration et l'implémentation d'algorithmes de détection de marquages en immunohistochimie et hybridation in situ, ensuite reconstruits en trois dimensions. Le développement de cette méthodologie constitue la base nécessaire à la mise au point d'une anatomie tridimensionnelle des centres respiratoires du tronc cérébral humain. Le développement d'une anatomie tridimensionnelle reconstruite à partir de coupes sériées doit permettre le transfert de données neuro-anatomiques à l'échelle cellulaire acquises post mortem, vers l'étude in vivo en imagerie par résonnance magnétique à haute résolution. Couplée à des explorations physiologiques, elle pourrait rendre possible l'exploration de corrélats anatomo-fonctionnels difficilement accessibles avec les niveaux de résolution actuels.

In mammals, breathing is an automated and regulated function, characterized by a rhythmic anduninterrupted activity of the respiratory system. It is responsible for the hematosis regulation during lifetime.Respiration and its central regulation originate within the brainstem and are highly preserved function amongmammals' evolution. The retrotrapezoid nucleus (RTN), in the brainstem, is a key structure of centralchemoregulation. Mandatory for the development of the RTN, mutations of the transcription factor PHOX2B causecongenital central hypoventilation syndrome (or Ondine's syndrome). The association of PHOX2B with othermarkers (such as VGluT2, NK1R, pre pro galanin, GPR4, etc…) defines a molecular identity card which can be usedin neurohistology to identify RTN chemosensitive neurons. Recent research has suggested a RTN dysfunction relatedto respiratory disorders in neurodegenerative diseases such as Parkinson's. To date, there is no description of this keyneural structure in adult humans.The first aim of this thesis was to propose a cell-scale anatomic description of chemosensitive neurons of the humanRTN. The second objective was to set the bases for the 3D reconstruction of histologic serial sections of the humanbrainstem, along with an automated detection algorithm for specific histologic staining. The overall goal to achievewould be to allow the visualization of anatomo-functional structures within a whole reconstructed organ, from postmortem histologic sections.Based on the hypothesis of a higly preserved respiratory neural regulation among mammals, we built a comparativeneuro anatomy approach to achieve our main goal. Preserved function presuppose preserved molecular signature,hence we first described the RTN in adult non-human primates with the same markers as previous descriptions inrodents. This intermediate description in M. fascicularis confirmed us the location of the region of interest as theparafacial region, to look for in humans. We therefore identified neurons co-expressing the pre pro galanin andVGluT2 in this region of interest in the human brainstem.Our study in non-human primates allowed to improve detection algorithm of specific in situ hybridization andimmunohistochemistry which could be used for 3D reconstruction of histologic serial sections. We set themethodological bases for the development of a 3D anatomy of respiratory neural centers in human. Such methods inroutine use open the field for translational approaches combining cell-