Etude de la septine 9 dans la polarité cellulaire et le développement du cholangiocarcinome

Study of septin 9 in the cell polarity and development of cholangiocarcinoma

• Auteur / Autrice : Ting ting Cai
• Direction : Ama Gassama-Diagne
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 14/12/2022
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie : biologie-médecine-santé (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Physiopathogenèse et traitement des maladies du foie (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université Paris-Saclay. Faculté de médecine (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Christian Poüs
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Laura Fouassier, Bruno Goud, Cécile Badoual, Manuel Théry, Didier Samuel
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Laura Fouassier, Bruno Goud

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transition épithélio-mésenchymateuse

Polarité (biologie)

Septines

Indicateurs biologiques

Cholangiocarcinome

Mots clés libres

Septine 9

Polarité

Transition épithélio-Mésenchymateuse

Cholangiocarcinome

“don't eat me” signal

Septin 9

Polarity

Epithelial mesenchymal transition

Cholangiocarcinoma

“don't eat me” signal

Résumé

Le cholangiocarcinome (CCA) est un cancer du foie très agressif dont l'incidence augmente dans le monde entier. C'est le deuxième cancer primitif du foie le plus fréquent après le carcinome hépatocellulaire (CHC). Le pronostic est sombre et la mortalité élevée. La chirurgie reste le seul traitement efficace et seuls quelques patients sont éligibles à cause du diagnostic bien souvent tardif. Il devient urgent de trouver des biomarqueurs pour un diagnostic précoce et un traitement adapté. Cependant de nombreuses questions demeurent quant au mode d'initiation et de progression du CCA. La septine 9 est un membre de la famille des septines qui sont des GTPases considérées comme des éléments du cytosquelette. Ces protéines possèdent deux domaines polybasiques (PB1) et (PB2) qui permettent leur oligomerisation pour former des structures filamenteuses et favoriser leur liaison aux membranes cellulaires permettant ainsi aux septines d'assurer leurs différentes fonctions biologiques. Les travaux du laboratoire sont à la base de la découverte du domaine PB2 qui forme avec le domaine PB1 un point d'ancrage aux membranes grâce à une liaison avec les phosphoinositides. Dans la première partie de ma thèse, à l'aide de différents mutants dépourvus d'un ou des deux domaines PB que nous avons construits, nos travaux ont démontré que la septine 9 est un régulateur clé de la polarité apico-basale et que ses deux domaines PB sont nécessaires à l'homéostasie tissulaire. En culture tridimensionnelle (3D), nous avons constaté que la septine 9 est localisée à la membrane basale et que la déplétion des deux domaines PB1 et PB2 empêche la localisation membranaire de la septine 9 et conduit à un phénotype de polarité inversée dans les organoides formés en culture 3D. Ces organoides possédant un phénotype de polarité inversée, présente également un caractère invasif avec une accumulation de la cortactine et de la kinase Src à la membrane périphérique. Nous avons également démontré que l'inhibition de RhoA et principalement celles des récepteurs du TGF beta (Transforming Growth Factor) pouvaient restaurer la polarité cellulaire dans les organoides. Dans une deuxième partie, nous avons analysé l'expression et le rôle de la septine 9 dans le CCA et en particulier dans le CCA intrahépatique ou CCAi. Nous avons réalisé des analyses bio-informatique sur des données de séquencage sur cellules uniques issues de CCAi. Les résultats de ces analyses ont montré que l'expression de la septine 9 était plus élevée dans les CCAi que dans les CHC. Nous avons également montré une expression différentielle de la septine 9 et de la vimentine (marqueur des cellules mésenchymateuses) dans les cellules de CCAi. Ceci nous a permis d'identifier des trajectoires cellulaires spécifiques des cellules tumorales du CCAi. Nous avons caractérisé deux sous-populations cellulaires, l'une enrichie en vimentine et en molécules impliquées dans le remodelage de la matrice extracellulaire (MEC) et l'autre enrichie en septine 9 et en molécules du système immunitaire. En effet dans ces cellules, nous avons trouvé une corrélation positive et significative entre l'expression de la septine 9 et les gènes impliqués dans la signalisation immunitaire et nommés ''don't eat me’genes'' qui bloquent la dégradation par le système immunitaire des cellules tumorales qui les expriment. De plus nous avons montré que l'expression de la septine 9 régule celle des protéines des signaux ''don't eat me''. Par ailleurs nous montrons que la septine 9 régule la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et contrôle négativement l'expression de la vimentine. Par conséquent, ces travaux nous permettent de conclure que la septine 9 est une protéine régulatrice de la polarité cellulaire et serait impliquée dans l'échappement des cellules tumorales au système immunitaire. Elle pourrait servir de biomarqueur pronostique et de cible thérapeutique potentiel du CCAi.

Cholangiocarcinoma (CCA) is a very aggressive liver cancer whose incidence is increasing worldwide. It is the second most common primary liver cancer after hepatocellular carcinoma (HCC). The prognosis is grim and the mortality high. Surgery remains the only effective treatment and only a few patients are eligible because of the often-late diagnosis. It is becoming urgent to find biomarkers for early diagnosis and appropriate treatment. However, many questions remain about the mode of initiation and progression of CCA. Septin 9 is a member of the septin family which are GTPases considered as elements of the cytoskeleton. These proteins have two polybasic domains (PB1) and (PB2) which allow their oligomerization to form filamentous structures and promote their binding to cell membranes, thus allowing the septins to carry out their various biological functions. The work of the laboratory is the basis of the discovery of the PB2 domain which forms with the PB1 domain an anchor to the membranes through their binding with phosphoinositides. In the first part of my thesis, using different mutants that we constructed and lacking one or both PB domains, we demonstrated that septin 9 is a key regulator of apico-basal polarity and that its two PB domains are required for tissue homeostasis. Using three-dimensional (3D) culture, we found that septin 9 is localized to the basolateral membrane of polarized organoids and that the depletion of both PB1 and PB2 domains prevents the membrane localization of septin 9 and leads to a reverse polarity phenotype in the organoids formed. These organoids possessing an inverted polarity phenotype, also present an invasive character with an accumulation of cortactin and Src kinase at the peripheral membrane. We have also demonstrated that the inhibition of RhoA and mainly that of TGF beta (Transforming Growth Factor) receptors could restore cell polarity in organoids. In a second part, we analyzed the expression and the role of septin 9 in the CCA and in particular in the intrahepatic CCA (CCAi). We performed bioinformatics analyzes on single cell sequencing data from CCAi. The results of these analyzes showed that the expression of septin 9 was higher in CCAi than in HCC. We also showed a differential expression of septin 9 and vimentin (marker of mesenchymal cells) in CCAi cells. This allowed us to identify specific cellular trajectories of CCAi tumor cells. We characterized two cell subpopulations, one enriched in vimentin and molecules involved in extracellular matrix (ECM) remodeling and the other enriched in septin 9 and immune system molecules. Indeed, in these cells, we found a positive and significant correlation between the expression of septin 9 and those of the genes involved in immune signaling and named ''don't eat me'' genes which block the degradation by the immune system of tumor cells that express them. In addition, we have shown that the expression of septin 9 regulates that of the ''don't eat me'' signal proteins. Furthermore, we show that septin 9 regulates the epithelial-mesenchymal transition (EMT) and negatively controls the expression of vimentin. Consequently, this work allows us to conclude that septin 9 is a protein that regulates cell polarity and would be involved in the escape of tumor cells from the immune system. It could serve as a prognostic biomarker and potential therapeutic target of CCAi.