Rôle des modifications des ARN dans la fidélité de la traduction chez les eucaryotes

Role of RNAs' modifications in eukaryotic translation fidelity

• Auteur / Autrice : Charlène Valadon
• Direction : Olivier Namy, Karen Perronet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance le 13/01/2022
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie intégrative de la cellule (Gif-Sur-Yvette, Essonne ; 2015-....) - Laboratoire Lumière, matière et interfaces (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2020-...)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Faculté des sciences d'Orsay
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Herman Van Tilbeurgh
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Alexandre David, Clément Carré, Valérie Heurgue Hamard
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Alexandre David, Clément Carré

Mots clés

Mots clés contrôlés

ARN ribosomiques

Molécule unique

ARN de transfert

Traduction génétique

ARN -- Modifications posttranscriptionnelles

Mots clés libres

Traduction

ARNt

Ribosomes specialisés

Molécule unique

Fidélité

Modifications des ARN

Fidelity

Translation

Single molecule

RNAs modifications

Specialized ribosomes

TRNAs

Résumé

La traduction possède un taux d’erreurs de 10⁻³ à 10⁻⁴ conservé chez l’ensemble du vivant. Chez l’Homme, plus de 100 modifications de l’ARN ont été décrites, certaines connues pour moduler la fidélité de la traduction. Lors de la terminaison de la traduction, la reconnaissance du codon stop par les facteurs de terminaison est en compétition avec la translecture, processus au cours duquel un ARNt proche cognat est incorporé au niveau du codon stop, le ribosome continuant alors la traduction jusqu’au prochain codon stop. La compréhension des mécanismes de translecture est d'autant importante qu'il s'agit d'un véritable enjeux thérapeutique pour des patients atteints de maladies génétiques à codon stop prématuré. Le premier axe de ma thèse consiste en l’étude de l’impact des modifications de la boucle anticodon des ARNt sur l’efficacité de translecture chez l’Homme. Au cours de ce projet j’ai réalisé la première analyse systématique des acides aminés incorporés au niveau des trois codons stop dans des cellules humaines en culture. Les résultats de spectrométrie de masse ont permis d'identifier les acides aminés Gln et Tyr au niveau des codons UAA et UAG, et les acides aminés Trp, Arg, Cys et Ser au niveau du codon UGA. J’ai ensuite étudié le rôle des modifications GalQ₃₄ et Ψ₃₅ de l’anticodon de l’ARNtTyr. J’ai pu mettre en évidence que ces deux modifications jouent deux rôles opposés dans la fidélité de la traduction. Alors que la présence de GalQ₃₄ diminuait l’efficacité d’incorporation de l’ARNtTyr au niveau des codons UAA et UAG, la présence de Ψ₃₅ était importante pour permettre l'incorporation de l'ARNt. Ces dernières années il est apparu que les modifications 2'-O-méthylation de l'ARNr jouaient un rôle important dans la régulation de la traduction en particulier dans les cellules cancéreuses. Le deuxième axe de ma thèse portait sur l’impact de la modification 2’-O-méthylation de l’ARNr dans la cinétique du ribosome en molécule unique par microscopie TIRF. Durant les étapes de mise au point du protocole, j'ai pu mettre en évidence que la cinétique d’initiation, à partir de l'IRES de l'EMCV, était bien plus rapide qu'à partir d'autres IRES (HCV ou CrPV).

Translation has an error rate of 10⁻³ to 10⁻⁴ that is conserved in all living organisms. In humans, more than 100 RNA modifications have been described, some of which are known to modulate the fidelity of translation. During translation termination, recognition of the stop codon by termination factors competes with readthrough, a process in which a cognate tRNA is incorporated at the stop codon and the ribosome continues translation to the next stop codon. The understanding of readthrough mechanisms is important because it is a real therapeutic issue for patients with genetic diseases with premature stop codon. The first axis of my thesis consists in the study of the impact of modifications of the tRNA anticodon loop on the efficiency of readthrough in humans. During this project I performed the first systematic analysis of amino acids incorporated at the three stop codons in human cells in culture. The mass spectrometry results identified the amino acids Gln and Tyr at the UAA and UAG codons, and the amino acids Trp, Arg, Cys and Ser at the UGA codon. I then investigated the role of the GalQ₃₄ and Ψ₃₅ modifications of the tRNATyr anticodon. I was able to highlight that these two modifications play two opposing roles in translation fidelity. While the presence of GalQ₃₄ decreased the efficiency of tRNATyr incorporation at the UAA and UAG codons, the presence of Ψ₃₅ was important to allow tRNA incorporation. In recent years, it appeared that 2'-O-methylation modifications of rRNA play an important role in the regulation of translation, especially in cancer cells. The second focus of my thesis was on the impact of 2'-O-methylation modification of rRNA in single molecule ribosome kinetics by TIRF microscopy. During the protocol development stages, I was able to demonstrate that the initiation kinetics from the EMCV IRES was much faster than from other IRES (HCV or CrPV).