Etude de l'assemblage et de l'activation de la NADPH oxydase de phagocyte au niveau des membranes cellulaires

Study of the assembly and activation of phagocyte NADPH oxidase in cellulo and in vitro

• Auteur / Autrice : Dina Al abyad
• Direction : Tania Bizouarn, Achraf Kouzayha, Sophie Dupré-Crochet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 08/12/2022
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay en cotutelle avec Ecole doctorale des Sciences et des Technologies (Tripoli, Liban ; 2007-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences chimiques : molécules, matériaux, instrumentation et biosystèmes (Orsay, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de chimie physique (Orsay, Essonne ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Faculté des sciences d'Orsay
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Chimie (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Marie Erard
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Franck Fieschi, Jamel El Benna, Marielle Valério-Lepiniec, Mariano Ostuni
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Franck Fieschi, Jamel El Benna

Mots clés

Mots clés contrôlés

NADPH Oxidase 2

Multimérisation de protéines

Liposomes

Interactions phospholipide-protéine

Microscopie de fluorescence

Espèces réactives de l'oxygène et de l'azote

Mots clés libres

Liposome géant

Assemblage de protéines

Ero

Microscopie de fluorescence

NADPH oxydase

Intéraction protéine-Lipide

Giant liposome

Fluorescence microscopy

Protein assembly

Lipid protein interaction

NADPH oxidase

Ros

Résumé

Les neutrophiles, cellules phagocytaires, détruisent les pathogènes envahissant le corps humain grâce à une production massive d'espèces réactives de l'oxygène (ERO ou FRO) dans un compartiment intracellulaire : le phagosome. Le précurseur de ces ERO, l'anion superoxyde est produit par la NADPH oxydase un complexe protéique formé à la membrane phagosomale. L'enzyme peut également être localisée dans la membrane plasmique et produit alors des ERO dans l'espace extracellulaire. Une surproduction d'ERO peut alors être responsable d'inflammations pathologiques alors que l'absence de NADPH oxydase est à l'origine d'une maladie grave, la granulomatose septique chronique (CGD) où les patients développent des infections récurrentes car ils sont incapables de détruire les pathogènes. Certains pathogènes peuvent aussi échapper à cette destruction en modifiant la membrane des phagosomes. La NADPH oxydase est finement régulée dans l'espace et le temps. Elle est constituée de six sous-unités : deux protéines membranaires (Nox2 et p22ᵖᵸᵒˣ) constituant le centre catalytique et quatre protéines cytosoliques (p67ᵖᵸᵒˣ, p47ᵖᵸᵒˣ, p40ᵖᵸᵒˣ et Rac). L'activation de Nox2 est basée sur l'assemblage des protéines cytosoliques avec les protéines membranaires. Cet assemblage se fait d'un part par des interactions entre les protéines et d'autre part, par des interactions avec les phospholipides. Le but de ma thèse a été d'étudier les interactions protéine-lipide qui se mettent en jeu afin d'activer Nox2. Une protéine de fusion chimérique appelée ''Trimère '' a été l'outil principal dans ce travail. Il est composé des domaines de p67ᵖᵸᵒˣ, p47ᵖᵸᵒˣ et Rac1 indispensable à l'activation de l'enzyme. Trois variants du trimère prototype ont été utilisés, les trimères mutants p47 ∆PX, Rac1 PB2 et Rac1 PB6Q. Les mutations ont été créés afin d'étudier l'implication des deux domaines d'interactions avec les lipides, PX de p47ᵖᵸᵒˣ et PB de Rac1 dans l'activation de Nox2. Suite à des mesures in vitro de production d'anion superoxyde par la NADPH oxydase et la détermination de l'affinité des trimères vis-à-vis des protéines membranaires de neutrophiles, complété par des mesures d'activité in cellulo, nous avons montré un rôle important du domaine PB de Rac1 pour la formation du complexe mais aussi pour son activité alors que le domaine PX est surtout important pour son assemblage in vitro. Dans la deuxième partie de ma thèse, l'étude s'est portée sur la fixation du trimère aux membranes en utilisant un système biomimétique : des liposomes de différentes compositions en phospholipides ainsi que la lignée de cellules myéloïde (PLB-985) différenciable en cellules phagocytaires. Les interactions entre les trimères et les membranes ont été détectés par microscopie confocale de fluorescence mais aussi par la technique de bio-layer-interférométrie. Ces expériences ont montré que le prototype se fixe très efficacement sur des liposomes contenant des phospholipides anioniques ainsi que sur la membrane plasmique et phagosomale de ces cellules phagocytaires. Le domaine PX s'est révélé très important pour la fixation du trimère sur ces liposomes alors que le domaine PB s'est montré de nouveau nécessaire pour une bonne fixation aux membranes plasmique et phagosomale des cellules PLB-985. Pour conclure, ces études ont montré un rôle important des interactions protéines-lipides pour le maintien du complexe mais aussi une régulation fine de la formation du complexe en fonction de la composition en phospholipides, qui demande à être mieux définie. Cette connaissance pourrait être utile pour contrôler la production d'anion superoxyde par la NADPH oxydase de phagocyte.

Neutrophils are phagocytic cells that destroy pathogens invading the human body through a massive production of reactive oxygen species (ROS) in an intracellular compartment: the phagosome. The precursor of these ROS, superoxide anion, is produced by the NADPH oxidase, a protein complex formed at the phagosomal membrane. The enzyme can also be localized in the plasma membrane and produce ROS in the extracellular space. An overproduction of ROS can then be responsible for pathological inflammations whereas an absence or a non-functional NADPH oxidase causes a serious disease named Chronic-granulomatous disease (CGD). Patients with CGD develop recurrent and severe infections. Some pathogens are able to escape destruction in the phagosome by, for example, modifying the phagosomal membrane composition or targeting the NADPH oxidase. NADPH oxidase is finely regulated in space and time. It consists of six subunits: two membrane proteins (NOX2 and p22ᵖᵸᵒˣ) constituting the catalytic center and four cytosolic proteins (p67ᵖᵸᵒˣ, p47ᵖᵸᵒˣ, p40ᵖᵸᵒˣ and Rac). The activation of NOX2 is based on the assembly of cytosolic proteins with membrane proteins. This assembly is done on the one hand by interactions between proteins and on the other hand by interactions with phospholipids. The aim of my thesis was to study the protein-lipid interactions that are involved in the activation of NOX2. A chimeric fusion protein called ''Trimera'' was the main tool in this work. It is composed of the p67ᵖᵸᵒˣ, p47ᵖᵸᵒˣ and Rac1 essential domains for the activation of the enzyme. Three variants of the prototype trimera were used, the p47 ∆PX, Rac1 PB2 and Rac1 PB6Q mutant trimeras. The mutations were created to study the involvement of the two lipid interaction domains, PX (Phox Homology) of p47ᵖᵸᵒˣ and the polybasic domain (PB) of Rac1, in NOX2 activation. Following in vitro measurements of superoxide anion production by NADPH oxidase and the determination of the affinity of the trimeras towards neutrophil membrane proteins, completed by in cellulo activity measurements, we have shown an important role of the PB domain of Rac1 for the formation of the complex but also for its activity while the PX domain is mainly important for its assembly in vitro. In the second part of my thesis, the study focused on the attachment of the trimer to membranes using a biomimetic system: liposomes of different phospholipid compositions and the myeloid cell line (PLB-985) differentiable into phagocytic cells. The interactions between the trimeras and the membranes were detected by confocal fluorescence microscopy but also by the biolayer-interferometry technique. These experiments showed that the prototype binds very efficiently to liposomes containing anionic phospholipids as well as to the plasma and phagosomal membrane of these phagocytic cells. The PX domain was shown to be very important for the binding of the trimera to these liposomes while the PB domain was shown again to be necessary for an efficient binding to the plasma and phagosomal membranes of PLB-985 cells. In conclusion, these studies have shown an important role of protein-lipid interactions for the maintenance of the complex but also a fine regulation of the complex formation according to the phospholipid composition, which needs to be better defined. This knowledge could be useful for a finely tuned regulation of the production of superoxide anion by the phagocyte NADPH oxidase.