Stratégies analytiques pour le prétraitement des glycanes en microréacteur enzymatique et en capillaire : vers une analyse intégrée de la glycosylation

Analytical strategies for in-enzyme microreactor and in-capillary glycan pretreatment : towards an integrated glycosylation analysis

• Auteur / Autrice : Bin Yang
• Direction : Myriam Taverna, Thuy Tran-Maignan
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 30/09/2022
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences chimiques : molécules, matériaux, instrumentation et biosystèmes
• Partenaire(s) de recherche : référent : Faculté des sciences d'Orsay
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Chimie (2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Galien Paris-Saclay (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 1998-....)
• Jury : Président / Présidente : Bruno Baudin
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Nathalie Delaunay-Bertoncini, Reine Nehmé, Benjamin Carbonnier
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Nathalie Delaunay-Bertoncini, Reine Nehmé

Mots clés

Mots clés contrôlés

Enzymes immobilisées

Glycoprotéines

Électrophorèse capillaire

Mots clés libres

Electrophorèse capillaire

Analyse glycannique

Microsystème

Glycoprotéines

Réacteur d'enzyme immobilisée

Marquage en capillaire

Capillary electrophoresis

Glycan analysis

Microsystem

Glycoproteins

Immobilized enzyme reactor

In-Capillary labeling

Résumé

La glycosylation est l'une des principales modifications post-traductionnelles des protéines. La détection de modifications mineures de la glycosylation des protéines peut aider à l’identification de nouveaux biomarqueurs diagnostiques ou au contrôle qualité des produits biothérapeutiques. La cartographie des glycanes est l'une des approches les plus efficaces mais cette stratégie reste encore limitée par les nombreuses et longues étapes de traitement d’échantillon. Ces étapes impliquent la libération, le marquage et l’analyse des glycanes par une technique de séparation. Ces opérations manuelles pouvant induire des interférences provoquent des problèmes de reproductibilité. La miniaturisation et l'automatisation des différentes étapes sont nécessaires mais restent difficiles. Les dispositifs mis au point pour la libération ou le marquage par fluorescence des glycanes concernent davantage les N- que les O-glycanes. A ce jour, aucun microréacteur avec des enzymes immobilisées (IMER) pour la libération de O-glycanes ou aucun marquage en capillaire de glycanes avec l'acide 8-aminopyrène-1,3,6-trisulfonique (APTS) n’a été reporté dans la littérature. Mon projet de thèse vise à contribuer au développement d'un microsystème intégrant la libération des glycanes des glycoprotéines, leur marquage fluorescent en ligne, et leur séparation par électrophorèse capillaire (EC) couplée à la détection par fluorescence induite par laser (LIF).La première partie expérimentale décrit le développement d'un IMER à base d'un monolithe photo-polymérisé pour libérer les O-glycanes des glycoprotéines. Un monolithe à base de poly(méthacrylate de glycidyl-co-poly(diacrylate d'éthylène glycol)) de 10 mm a été synthétisé dans un capillaire après optimisation des proportions monomère/réticulant et porogènes/monomères. Il présente une perméabilité relativement élevée et une bonne stabilité mécanique et chimique. Différentes chimies d'immobilisation, le temps d'immobilisation et la concentration en O-glycosidase ont également été testés. Les O-glycanes libérés de la fétuine ou l'asialofétuine ont ensuite été marqués avec l'APTS en tubes puis analysés par EC-LIF. Pour la première fois, une O-glycosidase active est immobilisée sur un support solide. La digestion in-IMER de l'asialofétuine a montré une efficacité similaire à celle de la digestion en solution (rendement de libération de 56%) mais avec une vitesse plus grande (temps de contact < 20 s). Dans la deuxième partie expérimentale, une stratégie de préconcentration électrocinétique a été étudiée pour augmenter la sensibilité de détection des N- et O-glycanes par EC-LIF. J'ai participé à une étude menée par un autre doctorant du laboratoire en appliquant ces optimisations aux O-glycanes. En utilisant de nouveaux électrolytes combinés à l’injection d’un grand volume d'échantillon par modulation du flux électroosmotique, un facteur d'enrichissement de ~ 200 a été obtenu pour différentes glycoprotéines (IgG, fétuine, érythropoïétine) et quel que soit le type (N-, O-) de glycanes.La troisième partie expérimentale présente le marquage fluorescent en ligne des N-glycanes avec l'APTS suivi de leur analyse par EC-LIF. Une stratégie de mélange basée sur la diffusion transversale des profils d'écoulement laminaire a été exploitée pour réaliser ce marquage à l'intérieur du capillaire de séparation. Après optimisation des paramètres de mélange, l'approche en capillaire a été appliquée avec succès au marquage et à la cartographie des N-glycanes issus de l'immunoglobuline G (IgG) humaine et de l'anticorps monoclonal Rituximab.En conclusion, ce travail de thèse a contribué à développer des méthodes innovantes pour la libération de O-glycanes en microréacteur, le marquage fluorescent en ligne de N-glycanes, leur séparation et leur préconcentration par EC. Toutes les étapes ont été réalisées au sein d'un capillaire en silice et sont donc intégrables pour développer un microsystème dédié à l'analyse des glycanes.

Glycosylation is one of the most critical post-translational modifications of proteins. Detecting minor modifications of protein glycosylation can help identify new diagnosis biomarkers or control the quality of biotherapeutics. The glycan mapping is one of the most efficient approaches to detecting glycosylation modifications but the workflow is still limited by the high number and time-consuming steps required to achieve it. These steps entail the glycan release, labeling, and profiling by a separation technique. These manual operations can induce interferences, provoking reproducibility issues. Miniaturization and automation of the workflow are still needed but remain challenging. For instance, devices developed for glycan release or glycan labeling kits focus more on N- than on O-glycans. Neither the O-glycan release in an immobilized enzyme reactor (IMER) nor the in-capillary labeling of glycans with the 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid (APTS) has been reported until now. My thesis project aims at contributing to the development of a microsystem, integrating the glycan release, their online fluorescent labeling, and their separation by capillary electrophoresis (CE) coupled with laser-induced fluorescence (LIF) detection.The first experimental part describes the development of an IMER based on a photo-polymerized monolith to release O-glycans from glycoproteins. A 10 mm poly (glycidyl methacrylate-co-poly (ethylene glycol) diacrylate) monolith was synthesized in a capillary after optimizing the monomer/crosslinker and porogens/monomers ratios. The optimized monolith showed a relatively high permeability and good mechanical and chemical stability. Different immobilization chemistries, immobilization time and O-glycosidase enzyme concentration were also tested. The O-glycans released from fetuin or asialofetuin were then offline fluorescently labeled with APTS and analyzed by CE-LIF. For the first time, an active O-glycosidase was immobilized on a solid support. The in-IMER digestion of asialofetuin provided a similar digestion efficiency to the in-solution one (releasing yield of 56%) and brought speed with a residence time for digestion of less than 20 s.In the second experimental part, an electrokinetic preconcentration strategy was investigated to increase the CE-LIF detection sensitivity of N- and O-glycans. I participated in the thesis study conducted by another PhD student in the lab by applying these optimizations to O-glycans. By using new background electrolytes combined with large volume sample injection via electroosmotic flow modulation, an enrichment factor of ~ 200 was obtained for different glycoproteins (IgG, fetuin, erythropoietin) whatever the type (N-, O-) of glycans.The third experimental part reports the online fluorescent labeling of N-glycans with APTS, followed by their subsequent online CE-LIF analysis. A mixing strategy based on the transverse diffusion of laminar flow profiles was exploited to achieve this labeling inside the separation capillary. After an in-depth optimization of the mixing parameters, the in-capillary approach was successfully applied to the labeling and mapping of N-glycans from human immunoglobulin G (IgG) and monoclonal antibody Rituximab.In conclusion, this thesis work contributed to developing innovative methods for O-glycan release, N-glycan online labeling, separation, and preconcentration by CE. All the steps were performed within a silica capillary and are therefore amenable to further integration for developing a microsystem dedicated to glycan analysis.