Lipidomique des eicosanoïdes en chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse dans le cadre de l'athérosclérose

Lipidomics of eicosanoids in liquid chromatography coupled to mass spectrometry in the context of atherosclerosis

• Auteur / Autrice : Kodjo Nouwade
• Direction : Pierre Chaminade, Sana Tfaili
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 30/05/2022
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences chimiques : molécules, matériaux, instrumentation et biosystèmes (Orsay, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Lipides : systèmes analytiques et biologiques (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Faculté des sciences d'Orsay
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Chimie (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Igor Clarot
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Nathalie Delaunay-Bertoncini, Estelle Pujos, François Fenaille
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Nathalie Delaunay-Bertoncini, Estelle Pujos

Mots clés

Mots clés contrôlés

Athérosclérose

Lipides -- Métabolisme

Chromatographie en phase liquide

Éicosanoïdes

Mots clés libres

Lipidomique

Eicosanoïdes

Chromatographie liquide

Spectrométrie de masse

Athérosclérose

Lipidomic

Eicosanoids

Liquid chromatography

Mass spectrometry

Atherosclerosis

Résumé

L'athérosclérose est une maladie immuno-inflammatoire multifactorielle aboutissant à une réduction de la lumière des artères due notamment au dépôt de lipides et de macrophages gorgés de cholestérol. La seule possibilité qu'ont ces cellules de se débarrasser du cholestérol en excès est de le céder à des accepteurs extracellulaires. Cet efflux du cholestérol est la première étape du transport inverse du cholestérol qui rapporte le cholestérol au foie, le seul organe capable de le dégrader. Des travaux récents dans l'unité interdisciplinaire Lip(Sys)² ont permis de montrer que des modifications chroniques de la composition en acides gras (AG) des phospholipides de la membrane des macrophages J774 et THP-1 par incorporation d'AG polyinsaturés, influencent la variation de l'efflux du cholestérol et semblent également dépendre de la lignée cellulaire. Parmi les pistes d'explorations du mécanisme moteur de cette variation d'efflux sont évoqués les eicosanoïdes qui impacteraient la phosphorylation des résidus sérine de la protéine d'efflux ABCA1 et modifieraient son fonctionnement. Les eicosanoïdes sont des molécules structurellement complexes, avec de nombreuses fonctions labiles. Leur détection et leur quantification constituent un défi du fait qu'elles sont présentes à l'état de trace dans les matrices biologiques. L'objectif de cette étude est de développer des méthodes en chromatographie liquide et en spectrométrie de masse pour la quantification des eicosanoïdes dans des modèles de macrophages (J774 et THP-1) dans différentes conditions inflammatoires mimant l'athérosclérose. La séparation chromatographique a été développée sur sept colonnes sélectionnées sur la base du modèle de soustraction hydrophobe. Une comparaison des performances chromatographiques en RP-HPLC via différents descripteurs a révélé que Accucore C30 semble appropriée pour la séparation des isomères et isobares d'eicosanoïdes. La méthode en RP-HPLC couplée au LTQ-Orbitrap® Velos Pro en mode DDA (Data Dependent Acquisition) a permis d'analyser l'ensemble des eicosanoïdes. Une segmentation du profil chromatographique et une optimisation des énergies de collision par HCD pour chaque eicosanoïde ont permis d'augmenter significativement la fréquence d'acquisition et le seuil de détection : de l'ordre de 2 pg pour quelques prostanoïdes et de 0.02-2 pg pour certains leucotriènes et espèces oxydées. Cette approche constitue une alternative à la détection des eicosanoïdes sur un spectromètre de masse en mode MRM. Cette nouvelle méthode a permis de suivre spécifiquement environ 24 eicosanoïdes et d'identifier des espèces sécrétées par les macrophages J774 et THP-1. Les profils quantitatif et qualitatif montrent une variation des eicosanoïdes dépendant du type cellulaire et du temps de stimulation. Une corrélation entre l'efflux du cholestérol et la variation entre les différentes familles d'eicosanoïdes a été mise en lumière au travers de quatre potentiels biomarqueurs, offrant ainsi des pistes pour la compréhension du développement de l'athérosclérose.

Atherosclerosis is a multifactorial immuno-inflammatory disease leading to a reduction of the arteries lumen due to the lipid and foam macrophages deposit. The only way to remove the excess accumulated cholesterol from foam macrophages is to transfer it to extracellular acceptors. This cholesterol efflux is the first step of the reverse cholesterol transport pathway that delivers cholesterol to the liver, the sole organ able to break it down. Recent work in the interdisciplinary unit Lip(Sys)² has shown chronic modifications of the phospholipids fatty acid (FA) composition in the membrane of J774 and THP-1 macrophages by incorporating polyunsaturated FAs influence the cholesterol efflux variation and would depend on the cell line. Among the driving mechanism of this efflux variation, eicosanoids would impact the serine residues phosphorylation of the ABCA1 efflux protein and affect its function. Eicosanoids are structurally complex molecules with many labile functions. Their detection and quantification are challenging because they are present at trace amounts in biological matrices. This study aims to develop liquid chromatography-mass spectrometry methods to quantify eicosanoids in macrophage models (J774 and THP-1) under different inflammatory conditions to mimic atherosclerosis.We developed chromatographic separation on seven columns based on the hydrophobic subtraction model. A comparison of the chromatographic performance in RP-HPLC through different descriptors revealed Accucore C30 as suitable for the eicosanoids' isomers and isobars separation. RP-HPLC method coupled to LTQ-Orbitrap® Velos Pro in DDA (Data Dependent Acquisition) mode permitted to monitor all eicosanoids of the study. A segmentation of the chromatographic profile and optimization of the collision energies by HCD for each eicosanoid increased the acquisition frequency significantly and the detection threshold: around 2 pg for some prostanoids and 0.02-2 pg for some leukotrienes and oxidized species. Thus, this approach constitutes an alternative for eicosanoids detection on Mass Spectrometry in MRM mode. This novel method monitored 24 eicosanoids and identified species released by J774 and THP-1 macrophages. The quantitative and qualitative profiles exhibited eicosanoids fluctuations depending on the cell type and the stimulation time. A correlation between cholesterol efflux and different eicosanoid families was highlighted through four potential biomarkers, thus offering leads for the understanding of atherosclerosis development.