Nouvelles approches de quantification des variations du protéome au niveau des protéines intactes : analyses expérimentales et computationnelles

New quantification approaches of proteome variations at the intact proteins level : experimental and computational analyses

• Auteur / Autrice : Nicolas Sénécaut
• Direction : Jean-Michel Camadro, Gaëlle Lelandais
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique, omiques, bioinformatique et biologie des systèmes
• Date : Soutenance le 22/06/2022
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Frontières de l'innovation en recherche et éducation (Paris ; 2006-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Jacques Monod (Paris ; 1997-....)
• Jury : Président / Présidente : Fernando Rodrigues-Lima
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Fernando Rodrigues-Lima, Emmanuelle Leize-Wagner, Willy Vincent Bienvenut, Denis Mestivier
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Emmanuelle Leize-Wagner, Willy Vincent Bienvenut

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéomique

Bioinformatique

Spectrométrie de masse

Mots clés libres

Spectrométrie de masse

Simple Light Isotope Metabolic labeling (SLIM)

Biologie computationnelle

Protéomique quantitative

Mass spectrometry

Simple Light Isotope Metabolic labeling (SLIM)

Computational biology

Quantitative proteomics

Résumé

La spectrométrie de masse à haute sensibilité et à haute résolution est un outil de mesure idéal permettant de décrire qualitativement et quantitativement, la dynamique et les variations de la composition du protéome. La complexité des spectres de masse produits s'explique par la présence d'isotopes dans les molécules biologiques analysées. Le « Simple Light Isotope Metabolic labeling » (SLIM), est une méthode de protéomique quantitative précédemment développée au laboratoire, au cours de laquelle la composition isotopique des protéines est modulée in vivo, par apport d'une source de carbone uniformément marquée au 12C qui permet la synthèse des acides aminés et donc des protéines ne contenant que du 12C. Durant cette thèse nous avons optimisé la version « Bottom-up » de la méthode SLIM par le développement d'un workflow automatique de traitement des données brutes, utilisant des méthodes algébriques permettant la modélisation des clusters isotopiques théoriques. Une description quantitative fine de chaque peptide est obtenue en mesurant le rapport entre les intensités isotopiques expérimentales et théoriques. Les valeurs quantitatives obtenues ont été validées expérimentalement par la comparaison de deux protéomes issus de souches de levure proches. L'observation des variations d'abondance des protéines marqueurs d'auxotrophies, démontre la sensibilité de la méthode. En complément de l'usage d'outils OpenSource et performants, nous avons produit un deuxième workflow similaire dont l'utilisation de ressources informatiques propriétaires (logiciel Proteome Discoverer) a été mis en œuvre dans le but d'optimiser l'extraction des intensités expérimentales des isotopologues dans les clusters isotopiques. Ce sont des données expérimentales critiques pour notre méthode de quantification. Nous avons par ailleurs développé des méthodes statistiques robustes dont l'objectif est d'évaluer et d'estimer le taux de fausses découvertes dans les résultats obtenus. Nous avons également adapté les méthodes de résolutions algébriques permettant la quantification dans l'éventualité de marquage incomplet des protéines, comme lors de l'étude d'organismes présentant des auxotrophies (les lignées cellulaires humaines). De manière analogue, une preuve de faisabilité de marquage indirect a été développée avec le nématode, ouvrant ainsi les perspectives pour des applications futures de la méthodes SLIM dans des sujets impliquant des organismes eucaryotes supérieurs. Le développement au préalable du bSLIM en Bottom-up nous a permis d'aborder les difficultés rencontrées lors de l'observation par spectrométrie de masse au niveau des protéines intactes (approches Top-down). En effet, la masse élevée de ces objets biologiques pose plusieurs contraintes techniques et technologiques, la principale étant qu'à cette échelle de masse, le nombre d'isotopes lourds dans les molécules est très grand. Les clusters isotopiques observés dans les spectres expérimentaux présentent donc une faible intensité de l'ion monoisotopique, rendant d'autant plus difficile sa mesure. C'est pourquoi nous avons développé une solution utilisant la distribution de Poisson de l'intensité des isotopologues dans chaque massif isotopique comme modèle théorique, pour décrire les clusters isotopiques en tSLIM, ce qui permet la quantification des protéines intactes. Le développement d'outils dédiés de traitement des données nous a permis de développer une méthode originale d'identification en top-down permettant, en plus de la quantification, la caractérisation des protéoformes.

High sensitivity and high resolution mass spectrometry is an ideal measurement tool to describe qualitatively and quantitatively the dynamics and variations of the proteome composition. The complexity of the mass spectra produced is explained by the presence of isotopes in the biological molecules analyzed. Simple Light Isotope Metabolic labeling (SLIM) is a quantitative proteomics method previously developed in the laboratory, in which the isotopic composition of proteins is modulated in vivo by the addition of a uniformly 12C-labeled carbon source that allows the synthesis of amino acids and thus of proteins containing only 12C. During this thesis we optimized the bottom-up version of the SLIM method by developing an automatic workflow for the processing of raw data, using algebraic methods to model the theoretical isotopic clusters. A fine quantitative description of each peptide is obtained by measuring the ratio between experimental and theoretical isotopic intensities. The quantitative values obtained were validated experimentally by comparing two proteomes from closely related yeast strains. The observation of abundance variations of auxotrophy marker proteins demonstrates the sensitivity of the method. In addition to the use of OpenSource and powerful tools, we have produced a second similar workflow using proprietary computer resources (Proteome Discoverer software) in order to optimize the extraction of experimental intensities from isotopic clusters. These are critical experimental data for our quantification method. We have also developed robust statistical methods to evaluate and estimate the false discovery rate in the obtained results. We have also adapted algebraic resolution methods for quantification in the event of incomplete protein labeling, such as when studying organisms with auxotrophies (human cell lines). Similarly, a proof of concept for indirect labeling has been developed with the nematode, thus opening the perspectives for future applications of the SLIM method in subjects involving higher eukaryotic organisms. The previous development of bSLIM in bottom-up allowed us to address the difficulties encountered when observing intact proteins by mass spectrometry (top-down approaches). Indeed, the high mass of these biological objects poses several technical and technological constraints, the main one being that at this mass scale, the number of heavy isotopes in the molecules is very large. The isotopic clusters observed in the experimental spectra thus present a weak intensity of the monoisotopic ion, making its measurement even more difficult. Therefore, we have developed a solution using the Poisson distribution of the isotopic intensity in each isotopic cluster as a theoretical model to describe the isotopic clusters in tSLIM, which allows the quantification of intact proteins. The development of dedicated data processing tools allowed us to develop an original top-down identification method allowing, in addition to the quantification, the characterization of proteoforms.