Encapsulation de cellules souches pluripotentes pour développer et produire à l'échelle des thérapies cellulaires biomimétiques

Pluripotent stem cell encapsulation to develop and scale up biomimetic cell therapies

• Auteur / Autrice : Philippe Cohen
• Direction : Nathalie Lefort
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et biologie du développement
• Date : Soutenance le 22/03/2022
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Frontières de l'innovation en recherche et éducation (Paris ; 2006-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Maladies Génétiques (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Jérôme Larghero
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jérôme Larghero, John De Vos, Danijela Vignjevic, Pierre Nassoy, Maxime Feyeux, Lucie Laplane
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : John De Vos, Danijela Vignjevic

Mots clés

Mots clés contrôlés

Feuillets embryonnaires

Cellules souches pluripotentes

Biomimétique

Bioréacteurs

Thérapeutique cellulaire

Mots clés libres

Cellules souches pluripotentes

Épiblaste

Encapsulation

Bioréacteur

Thérapie cellulaire

Biomimétisme

Organoïde

Pluripotent stem cells

Epiblast

Encapsulation

Bioreactor

Cell therapy

Biomimetics

Organoids

Résumé

Les thérapies cellulaires suscitent l’espoir de millions de patients souffrant de maladies chroniques ou en impasse thérapeutique. Les cellules souches pluripotentes en constituent la matière première de choix. La bioproduction des cellules souches est considérée comme la clef de voûte de l’industrialisation des procédés. Toutefois, les technologies de culture de ces cellules souches sont encore récentes – le travail fondateur de Shinia Yamanaka sur les cellules souches pluripotentes induites a été récompensé par le prix Nobel de médecine en 2012. La problématique de cette thèse est une question industrielle fondamentale : comment passer à l’échelle la bioproduction de cellules souches pluripotentes humaines sans en altérer l’identité et l’intégrité génétique ? Nous proposons une approche biomimétique d’encapsulation des cellules souches pluripotentes qui permet de les cultiver en suspension automatisée dans des bioréacteurs de grande taille. Grâce à un système microfluidique de coextrusion haut débit, nous pouvons produire des milliers de capsules par seconde par injecteur. Les microcapsules produites, qui ont environ 400 μm de diamètre, sont creuses et protègent les cellules durant le processus de production. L’espace interne des capsules nous permet de mimer la niche des cellules in vivo. Nous avons observé que les microcompartiments biomimétiques permettent aux cellules souches pluripotentes de s’auto-organiser sous forme de colonies en 3D cystiques semblables à l’épiblaste durant l’embryogenèse. Nous appelons cette stratégie de culture « épiblastoïdes encapsulés ». Ces épiblastoïdes encapsulés, cultivés en suspension en bioréacteur, maintiennent la pluripotence en culture de manière homogène, reproductible et prolongée. Ils aident également à atteindre des facteurs d’amplification inégalés pour de grands volumes de culture (x 282 en 6,5 jours dans un bioréacteur de 10 litres). Lors d’une culture prolongée, nous avons aussi montré que la sélection de la ‘mutation 20q11.21’ (par duplication du grand bras du chromosome 20) est réduite d’un ordre de grandeur par rapport aux cultures conventionnelles. La viabilité des cellules souches pluripotentes dans notre système de culture (> 98 %), très supérieure au système classique, explique probablement l’amélioration des facteurs d’amplification et la diminution de la pression de sélection. Nous présentons des résultats préliminaires d’histologie et de biophysique des épiblastoïdes. L’encapsulation protège les cellules des atteintes mécaniques au sein des bioréacteurs et permet de reconstituer une niche biomimétique à l’échelle microtissulaire. Nous espérons que la combinaison de cette protection et de ce biomimétisme permettra de produire des thérapies issues de cellules souches pluripotentes sûres et efficaces pour des millions de patients.

Cell therapies represent hope for millions of patients with chronic diseases or unmet medical needs. Pluripotent stem cells have emerged as the most promising cellular source to produce them. The bioproduction of stem cells is considered as the keystone of the industrialization processes. However, the technologies for culturing these stem cells are quite recent – Shinia Yamanaka's seminal work on induced pluripotent stem cells was awarded the Nobel Prize for Medicine in 2012. The focus of this thesis is a fundamental industrial question: how to scale up human pluripotent stem cell bioproduction while preserving their identity and genetic integrity ? We propose a biomimetic approach to encapsulate pluripotent stem cells that allows them to be grown in automated suspension culture in large-scale bioreactors. Thanks to a microfluidic high-throughput coextrusion device we are able to generate thousands of capsules per second per injector. The microcapsules produced (~400μm in diameter), are hollow and protect the cells during the production process. This inner space is partially liquid and allows us to engineer the cell micro-environment to mimic the in vivo cell niche. In those biomimetic compartments, we observed self-organization of pluripotent stem cells as cystic 3D colonies reminiscent of the epiblast during embryogenesis. We call this culture strategy ''encapsulated epiblastoids''. These encapsulated epiblastoids, cultured in bioreactor suspension (C-STEM), maintain pluripotency in culture in a homogeneous, reproducible and prolonged manner, while reaching unprecedented amplification factor for large culture volumes (282 fold in 6.5 days in 10 liter bioreactor). We also have shown that selection of chromosomic mutation ‘20q11.21’ (by duplication of the large arm of chromosome 20) in long term culture is reduced by one order of magnitude compared to conventional culture systems. The higher pluripotent stem cell viability (>98%) in our culture system, compared to traditional system, probably explains the improvement of the amplification factors and the decrease of pressure selection. We present preliminary results describing histological and biophysical findings of epiblastoids. The encapsulation protects the cells from mechanical damage within the bioreactors and allows the reconstruction of a biomimetic niche at the microtissue level. Combining mechanical protection and biomimicry could help to overcome the current quantitative and qualitative limits of stem cell derived therapies bioproduction.