Synthèse et caractérisation biochimique de nouveaux motifs à incorporer dans des aptamères

Synthesis and biochemical characterization of novel moieties to be incorporated in aptamers

• Auteur / Autrice : Chiara Figazzolo
• Direction : Marcel Hollenstein
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et structurale et biochimie, biophysique moléculaire
• Date : Soutenance le 21/11/2022
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Frontières de l'innovation en recherche et éducation (Paris ; 2006-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Chimie bioorganique des acides nucléiques (Paris) (2022-....)
• Jury : Président / Présidente : Sylvie Pochet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marcel Hollenstein, Sylvie Pochet, Françoise Debart, Dominique Guianvarc'h, Laurent Micouin, Piet Herdewijn, Michel Arthur
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Françoise Debart, Dominique Guianvarc'h

Mots clés

Mots clés contrôlés

Vancomycine

Technique SELEX

Aptamères nucléotidiques

Paludisme

Ferrocène

Résistance aux antibiotiques

Vancomycine

Méthode SELEX

Aptamères

Mots clés libres

Aptamères

Selex

Vancomycine

Résistance aux antibiotiques

Ferrocène

Paludisme

Site abasique

Aptamers

Selex

Vancomycin

Antibiotic resistance

Ferrocene

Malaria

Abasic site

Résumé

Les aptamères sont des oligonucléotides (ONs) simple brin d'ADN ou d'ARN qui sont considérés comme les analogues des anticorps pour les acides nucléiques. Ils peuvent adopter des formes 3D uniques et se lier à des cibles spécifiques avec une affinité et une sélectivité élevées. Les aptamères peuvent être produits en criblant de grandes populations d'ONs par la méthode Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment (SELEX) contre une grande variété de cibles. Cette thèse avait le double objectif d'identifier de nouveaux nucléotides (NTs) chimiquement modifiés pouvant être utilisés dans le processus SELEX pour identifier des aptamères et de développer une méthode innovante pour suivre l'incorporation en temps réel de nucléosides triphosphates artificiels dans l'ADN. Dans la première section, nous avons combiné les capacités des aptamères et des antibiotiques pour tenter de lutter contre la résistance aux antibiotiques. Plus précisément, nous nous sommes concentrés sur la vancomycine (Vc). Une forme de résistance à cet antibiotique a été observée chez S. aureus qui peut altérer une terminaison du peptidoglycane, entraînant une réduction de la liaison à la Vc et une incapacité à empêcher la synthèse de la paroi bactérienne. L'identification d'un aptamère porteur de Vc pourrait potentiellement utiliser les propriétés de liaison de l'aptamère pour forcer mécaniquement la Vc dans le site de liaison et ainsi permettre sa fonction malgré la mutation. Dans ce chapitre, une nouvelle désoxyuridine modifiée par la Vc a été synthétisée avec succès et sa capacité à être incorporée dans l'ADN par synthèse enzymatique a été prouvée, confirmant ainsi sa compatibilité avec la méthode SELEX. Ce travail représente un premier pas vers la formation de nouveaux agents thérapeutiques. Dans la 2ème section, l'objectif était d'identifier un aptamère contenant du ferrocène (Fc) se liant spécifiquement à la lactate déshydrogénase de P. vivax (PvLDH), un biomarqueur du paludisme. Le Fc est caractérisé par des propriétés d'oxydoréduction particulières, qui en font un marqueur électrochimique largement utilisé. En effet, les aptamères portant du Fc pourraient servir de capteurs électrochimiques pour des cibles spécifiques en améliorant la limite de détection et en donnant potentiellement des indications sur le mécanisme de liaison à la cible. Dans une première étape vers cet objectif ambitieux, nous nous sommes demandés si les résidus cubane d'un aptamère modifié spécifique contre la PvLDH pouvaient être remplacés par des isostères sans induire une diminution importante de l'affinité et de la spécificité de liaison. Cela permettrait d'introduire des fragments de Fc sans devoir recourir à un processus SELEX relativement long et incertain. Dans ce contexte, des NTs portant des fragments benzyle et Fc, qui sont tous des isostères, ont été synthétisés et leur incorporation enzymatique dans l'ADN a été confirmée. En effet, ils ont pu être inclus dans la séquence d'un aptamère portant des isostères précédemment rapportés et ciblant la PvLDH. Des études de liaison en présence de la cible ont été réalisées pour comparer les valeurs de liaison de l'aptamère original avec celles des aptamères modifiés au Fc et au benzyle. Dans la 3ème section, une fraction de Fc a été inclus dans une série d'ONs pour étudier son analogie avec un site abasique naturel, qui représente un dommage de l'ADN résultant de l'abstraction d'une nucléobase. Les propriétés redox du Fc pourraient être utiles pour construire des capteurs électrochimiques permettant de surveiller en temps réel l'incorporation enzymatique de NTs modifiés dans l'ADN. Ce travail a prouvé que le Fc se comporte comme un site abasique classique et la désoxyadénine s'incorpore préférentiellement en face de tels sites. Il s'agit donc d'une première étape vers l'application du Fc comme marqueur électrochimique pour surveiller l'incorporation de triphosphates artificiels dans l'ADN.

Aptamers are single-stranded DNA or RNA oligonucleotides which are considered as the nucleic acids' analogues of antibodies. They can fold into unique 3D shapes and bind to specific targets with high affinity and selectivity. Aptamers can be produced by screening large populations of oligonucleotides through Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment (SELEX) against a wide variety of targets, including small molecules, proteins and more complex systems. This thesis had the dual objective of identifying novel chemically modified nucleotides to be included in aptamers and developing an innovative method to monitor the real time incorporation of artificial nucleosides triphosphates in double stranded (ds) DNA. Specifically, this work can be divided into three Chapters, each concerning a specific application. In the first section, the idea was to combine the potencies of aptamers and antibiotics as an innovative solution to fight antibiotic resistance. Specifically, we focused on vancomycin, an antibiotic that is used to treat different bacterial infections. A form of its resistance has been widely observed in Staphylococcus aureus which can alter a peptidoglycan terminus, resulting in reduced vancomycin binding and failure to prevent bacterial wall synthesis. The identification of a vancomycin-bearing aptamer would potentially use the aptamer binding properties to mechanically force the vancomycin in the binding site and allow its function despite the mutation. In this Chapter, a novel vancomycin-modified deoxyuridine was successfully synthesized and its capability to be incorporated into DNA via enzymatic synthesis was proved, hence confirming its compatibility with SELEX experiments. Therefore, this work represents a first step towards the formation of new therapeutic agents composed by aptamers and antibiotics. In the second section, the aim was to identify a ferrocene-bearing aptamer specifically binding to the Plasmodium vivax lactate dehydrogenase (PvLDH), an important malaria biomarker, to develop point-of-care biosensing devices. Ferrocene is characterized by peculiar redox properties, which make it a widely-used electrochemical tag with a specific readout signal. Indeed, ferrocene-bearing aptamers could serve as electrochemical sensors for specific targets by improving the limit of detection and potentially giving insights into the binding mechanism to the target. In a first step towards this ambitious aim, we questioned whether cubane residues of a highly potent, modified aptamer against PvLDH could be replaced with isosteres without inducing a severe depletion in binding affinity and specificity. This would permit the introduction of ferrocene moieties without the need of a lengthy selection protocol. In this context, nucleotides bearing benzyl and ferrocene moieties, which all are isosteres, were synthesized and their enzymatic incorporation in DNA was confirmed. Indeed, they could be included in the sequence of a previously reported cubane-bearing aptamer targeting the PvLDH. Binding studies in presence of the target were performed to compare the binding values of the original aptamer with the ones of the ferrocene and benzyl modified ones. Finally, in the third section a ferrocene moiety was included in a series of oligonucleotides to study its analogies with naturally occurring abasic sites, which are DNA damages that result from the abstraction of a nucleobase. Indeed, the redox properties of ferrocene could be useful to build electrochemical sensors for real-time monitoring of the enzymatic incorporation of modified nucleotides in the DNA. This work proved that ferrocene behaves as a classical abasic site and is preferentially incorporated in front of deoxyadenine (dA), respecting the 'A rule' characteristic of abasic sites. Therefore, it represents a first step towards the application of ferrocene as an electrochemical tag to monitor the incorporation of artificial triphosphates into DNA.