Insertion membranaire et translocation de la toxine CyaA de Bordetella pertussis

Membrane insertion and translocation of the CyaA toxin from Bordetella pertussis

• Auteur / Autrice : Mirko Sadi
• Direction : Alexandre Chenal
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 19/10/2022
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité Biochimie des interactions macromoléculaires (Paris)
• Partenaire(s) de recherche : Structure de recherche : Institut Pasteur. Département de Biologie structurale et chimie (2006-….)
• Jury : Président / Présidente : Nadia Izadi-Pruneyre
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marie Galloux, Stéphanie Petrella
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Marie-Béatrice Valerio-Lepiniec, Gregor Anderluh

Mots clés

Mots clés contrôlés

Toxine d'adénylate cyclase

Membrane cellulaire

Spectroscopie de la résonance magnétique nucléaire

Calmoduline

Peptides antimicrobiens

Bordetella pertussis

Mots clés libres

Pertussis

CyaA

RMN

Calmoduline

Calmidazolium

Amphiphilicité

Peptides antimicrobiens

Partitionnement membranaire

Pertussis

CyaA

NMR

Calmodulin

Calmidazolium

Amphiphilicity

Antimicrobial peptides

Membrane partitioning

Résumé

Le sujet de mon projet de recherche consiste à élucider le mécanisme unique de translocation de la toxine CyaA de Bordetella pertussis (B. pertussis), l'agent responsable de la coqueluche. La coqueluche est une maladie très contagieuse causée par la colonisation des voies respiratoires par B. pertussis. Cette maladie est une préoccupation internationale et menace particulièrement les enfants. Au cours de l'intoxication, B. pertussis produit plusieurs facteurs de virulence pour initier et soutenir la colonisation ainsi qu'éviter la réponse immunitaire de l'hôte. Un facteur de virulence majeur est l'exotoxine CyaA qui participe essentiellement à la colonisation précoce des voies respiratoires et perturbe la défense de l'hôte en tant que facteur anti-phagocytaire et anti-inflammatoire. La toxine CyaA est constituée de cinq régions distinctes qui sont essentielles à sa fonctionnalité : le domaine enzymatique de l'adénylate cyclase (ACD), une région de translocation (TR), une région hydrophobe (HR), un domaine d'acylation (AR) et un domaine RTX (Repeat In ToXin), (RD). Nous avons cherché à élucider le mécanisme de translocation pendant mon projet de thèse. Il a été démontré que le TR de CyaA est essentiel pour l'invasion cellulaire, puisque sa délétion abolit complètement la translocation de l'ACD (Karst et al. 2012, Subrini et al. 2013). Plus précisément, il contient un peptide actif sur la membrane, P454 (résidus 454-485), qui est capable de partitionner et de déstabiliser la membrane plasmique. Dans la première partie de la thèse, nous avons cherché à caractériser les propriétés et la contribution des résidus de P454. Nous avons analysé l'effet des mutations dans les peptides dérivés de P454 sur son affinité avec les bicouches lipidiques. Nous avons également démonté que P454 interagit avec forte affinité avec la calmoduline. Ainsi, nous avons pu démontrer le rôle crucial du segment P454 dans la voie d'invasion des cellules par CyaA. Ceci nous a conduit à la proposition d'un modèle pour le mécanisme de translocation de l'ACD, dans lequel P454 interagit avec la membrane plasmique et après sa translocation dans le cytosol, P454 est piégé par la calmoduline. La perméabilisation de la membrane induite par la P454 minimiserait alors l'énergie nécessaire à la translocation de l'ACD à travers la membrane cellulaire. Ce travail, dont j'ai été co-premier-auteur, a été récemment publié dans le journal Advanced Science (Voegele et al. 2021). Dans la deuxième partie de ma thèse, nous avons réalisé des études de caractérisation structurelle du complexe que la calmoduline forme avec son antagoniste, le calmidazolium (CDZ). Nous avons été en mesure de résoudre la structure du complexe calmoduline:CDZ. Ce dernier imite ceux induits par les peptides de liaison à CaM dérivés des protéines de liaison à CaM. Ces connaissances structurelles du complexe formé par la calmoduline et CDZ ouvrent la voie au développement de molécules inhibitrices sélectives de CaM pour la recherche fondamentale ainsi que pour la découverte et le développement de médicaments. Le manuscrit de ce travail a été récemment soumis au journal BMC Biology. Dans la troisième partie de ma thèse, nous avons cherché à déterminer l'affinité de CyaA pour diverses espèces lipidiques présentes dans les membranes cellulaires. Comme les méthodes établies pour la détermination du partitionnement membranaire ne sont pas adaptées à CyaA, nous avons conçu et établi une nouvelle approche basée sur la RMN sans marquage. Cette méthode permet la quantification du partitionnement de CyaA dans les bicouches lipidiques. Ainsi, elle pourrait contribuer de manière significative à l'élucidation du rôle des espèces lipidiques de la membrane plasmique dans la délivrance de l'ACD dans le cytosol. Le manuscrit de ce travail dont je suis le premier auteur est actuellement en préparation.

The subject of my research project is to elucidate the unique mechanism of translocation of the CyaA toxin produced by Bordetella pertussis (B. pertussis), the causative agent of whooping cough. This disease is of international concern and threatens particularly children of young age. During intoxication, B. pertussis produces several virulence factors to initiate and sustain colonization as well as to evade the host immune response. A major virulence factor is the exotoxin CyaA, which is primarily involved in early colonization of the respiratory tract and disrupts host defense as an anti-phagocytic and anti-inflammatory factor. The CyaA toxin consists of five distinct regions which are essential for its functionality: The enzymatic adenylate cyclase domain (ACD), a translocation region (TR), a hydrophobic region (HR), an acylation domain (AR) and a repeat-in toxin, RTX domain (RD). We aimed to contribute to the elucidation of the translocation mechanism during my thesis project. It has previously been shown (Karst et al. 2012, Subrini et al. 2013) that the TR of CyaA is essential for cell invasion, since its deletion completely abolishes the translocation of the ACD. More precisely, it contains a membrane active peptide, P454 (residues 454-485), which is capable of partitioning and destabilizing the plasma membrane. In the first part of the thesis, we sought to characterize the properties and contribution of amino acid residues. Therefore, we analyzed the effect of mutations in P454-derived peptides on its affinity towards lipid bilayers. Additionally, we have shown that P454 has a strong affinity for calmodulin. Thus, we were able to demonstrate the crucial role of the P454 segment in the cell invasion pathway of CyaA. This led us to propose a model for the translocation mechanism of CyaA, in which P454 interacts with the plasma membrane, translocates and binds CaM in the cytosol. This would lead to the trapping of P454 inside the cytosol and finally to the translocation of ACD by entropic pulling. This work, which I co-first-authored, has been recently published (Voegele et al. 2021). In the second part of my thesis, we performed structural characterization studies of the complex that CaM forms with its strong antagonist, calmidazolium (CDZ). We were able to provide structural insights into the CaM:CDZ complex that mimic those induced by CaM-binding peptides derived from CaM-binding proteins. These structural insights into the complex formed by CaM and CDZ pave the way for the design of selective CaM inhibitor molecules for basic research as well as for drug discovery and development. The manuscript of this work, in which I am the third author, has been recently submitted to the BMC Biology Journal. Finally, in the third part of my thesis, we sought to determine the affinity of CyaA for various lipid species present in cell membranes. Since established methods for determining membrane partitioning are not suitable for CyaA, we designed and established a new approach based on label-free NMR. The method we established allows in-solution quantification of CyaA partitioning in lipid bilayers and thus the determination of its affinity for various lipid species. Thus, we expect it to significantly contribute to the elucidation of the role of lipid species in the plasma membrane in ACD delivery into the cytosol. The manuscript of this work in which I am the first author, is currently in preparation.