Synthèse et caractérisation physico-chimique de polymères amphiphiles, les amphipols : application à l'étude structurale des protéines membranaires par cryo-microscopie électronique

Synthesis and physico-chemical characterization of amphiphilic polymers, the amphipols : application to the electron cryo-microscopy structural study of membrane proteins

• Auteur / Autrice : Baptiste Michon
• Direction : Manuela Zoonens
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance le 05/12/2022
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de biologie physico-chimique des protéines membranaires (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Cécile Breyton
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Cécile Breyton, Olivier Lambert, Yvette Tran, Patrick Guenoun, Vincent Chaptal
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Olivier Lambert, Yvette Tran

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cryomicroscopie

Composés amphiphiles

Protéines membranaires

Mots clés libres

Activité

Amphipol

Cryo-Microscopie électronique

Détergent

Film aqueux mince

Interface air/eau

Lipides

Protéine membranaire

Solubilisation

Tensioactif

Tension de surface

Activity

Air/water interface

Amphipol

Detergent

Electron cryo-Microscopy

Lipids

Membrane protein

Solubilization

Surface tension

Surfactant

Thin aqueous film

Résumé

Le travail de thèse présenté ici suit deux axes de recherche avec, comme fil rouge, une famille de polymères amphiphiles, les amphipols, conçus pour l'étude des protéines membranaires. L'obtention de structures tri-dimensionnelles (3D) fines des protéines est essentielle dans le processus de compréhension de leur fonctionnement, et l'identification d'éventuels sites d'intérêts, tels que des sites de liaison de substrats. Jusqu'en 2013, de telles structures étaient principalement obtenues par cristallographie des rayons X. L'essor de la microscopie électronique en tant qu'alternative a progressivement donné accès à des reconstructions 3D de grande précision (structures de quelques Å de résolution) à partir d'images bi-dimensionnelles (2D) de particules isolées, maintenues dans un environnement aqueux vitrifié par cryogénie (cryo-microscopie électronique, cryo-EM). La technique est toutefois venue avec son lot de difficultés à surmonter, notamment en ce qui concerne l'obtention de bonnes conditions d'imagerie (homogénéité de la glace, orientation aléatoire des particules, ...). C'est ici que l'amphipol A8-35 fait son entrée, son ajout empirique dans plusieurs études indépendantes ayant conduit à une amélioration significative des caractéristiques des échantillons observés. Le premier objectif du travail effectué a été d'investiguer le rôle de l'A8-35 et celui d'un détergent très utilisé, le dodécylmaltoside (DDM), sur la préparation d'échantillons de cryo-EM. A cet effet, les propriétés physico-chimiques de solutions aqueuses contenant l'A8-35 et le DDM (stabilité de films minces, tension de surface, propriétés de mouillage) ont été comparées aux caractéristiques d'échantillons de cryo-EM (stabilité de films, distribution d'épaisseur de glace) préparés à concentrations variables pour chacun des tensioactifs. Les résultats obtenus, mettant notamment en évidence un gain de qualité et de reproductibilité des grilles préparées avec des solutions d'A8-35 dépassant une concentration seuil, ont ensuite été mis à profit pour améliorer l'étude structurale d'une protéine membranaire modèle, le récepteur m5-HT3A de souris, maintenu en solution en présence d'A8-35. A l'origine de son développement, l'amphipol A8-35 avait été proposé comme alternative aux détergents, ces derniers étant classiquement employés pour extraire les protéines de l'environnement membranaire et les maintenir en solution aqueuse en empêchant leur agrégation due à leur domaine transmembranaire hydrophobe. Toutefois, les détergents se montrent parfois « agressifs » vis-à-vis des protéines membranaires, induisant leur dénaturation partielle, voir leur dissociation. Les velléités de s'affranchir de cet inconvénient ont conduit au développement de tensioactifs moins invasifs (amphipols, SMA, ...), ainsi qu'à l'échafaudage d'assemblages supramoléculaires (nanodisques, liposomes, ...). L'A8-35, bien qu'encore extensivement utilisé, s'est vu progressivement relégué au second plan en raison de la variabilité de ses propriétés d'extraction des protéines de l'environnement membranaire en fonction du système d'étude. Cette limitation a été levée grâce au développement de polymères dérivés de l'A8-35 porteurs de groupes hydrocarbonés cycliques, les CyclAPols. Le second objectif du travail réalisé a été de poursuivre la synthèse et la caractérisation d'une banque de CyclAPols. A cet effet, ils ont été testés sur deux protéines membranaires modèles : la bactériorhodopsine, présente dans la membrane pourpre, et le transporteur BmrA, exprimé dans la membrane plasmique d'E.coli. Ils ont notamment été comparés de manière prometteuse aux actuels polymères de référence, les SMAs, tant sur le plan de l'efficacité d'extraction des protéines membranaires avec préservation d'un environnement lipidique natif, que sur le plan de la stabilité des protéines et de la conservation de l'activité protéique, tout en mettant en évidence une variabilité des propriétés en fonction du système étudié.

The present PhD work follows two research axes with, as guiding thread, a family of amphiphilic polymers designed for the study of membrane proteins, the amphipols. Getting sharp tri-dimensional (3D) structures of proteins is key to understand how they work, and identify active sites, such as substrate-binding sites. Until 2013, such structures were mainly obtained through X-ray crystallography experiments, which required protein crystallization, a step of varying difficulty depending on the studied system. Electron microscopy rose as an alternative and progressively gave access to high-resolution 3D-reconstructions (resolution down to a few Å), based on bi-dimensional (2D) images of isolated particles in an aqueous, vitrified environment (electron cryo-microscopy, cryo-EM). Still, the technique came with its share of challenges, especially when it comes to achieving some control over sample preparation. This proved to be a bothersome bottleneck, as securing proper and reproducible imaging conditions (stable and homogeneous ice, randomly oriented particles, ') is key to obtain sharp 3D-structures. That is where the amphipol A8-35 comes in action, due to its empirical use in several independent studies which led to a significant sample quality improvement. The first aim of the present work was to look into the impact of A8-35 on cryo-EM sample preparation and compare the data with that of a frequently used detergent, dodecylmaltoside (DDM). To this end, the physico-chemical properties of A8-35-containing and DDM-containing aqueous solutions (thin film stability, surface tension, wetting properties) were compared to the characteristics of cryo-EM samples (film stability, ice thickness distribution) prepared at various concentrations of each surfactant. The results, which notably highlighted a significant quality and reproducibility gain for A8-35 concentrations above a threshold, were then put to use to improve the structural study of a model membrane protein, the mouse receptor m5-HT3A, kept in solution by the A8-35. At the beginning of its development, the amphipol A8-35 had been proposed as an alternative to detergents, which are classically used to extract proteins from their membrane environment and to keep them in an aqueous medium while preventing their aggregation by shielding their hydrophobic transmembrane domain. However, detergents sometimes proved to be too 'aggressive' for the membrane proteins, provoking their partial denaturation, or even their dissociation. Aiming at avoiding such hazards, softer surfactants (amphipols, SMAs, ') were developed, and supramolecular assemblies (nanodiscs, liposomes, ') were designed. The A8-35, even if still widely used, was progressively left aside, due to its unreliable MP extracting properties, which depends heavily on the studied system. This restriction was overcome with the development of new polymers, derived from the A8-35, and bearing cyclic hydrocarbon groups, the CyclAPols. The second aim of the present work was to keep going with synthesis and characterization of a library of CyclAPols. To this end, the CyclAPols were tested on two model membrane proteins: the bacteriorhodopsin, which can be found in the purple membrane, and the transporter BmrA, expressed in the plasma membrane of E.coli. More specifically, a promising comparison was operated between the CyclAPols and the current standard polymer for membrane protein study, the SMAs. It included a look at their capacity to extract membrane proteins while preserving a native lipidic environment, as well as at the conservation of protein stability and activity, and underlined some property variability depending on the studied system.