Rôle de la stomatine dans la modulation de canaux ioniques mécanosensibles : impact sur les défauts d'hydratation du globule rouge

Role of stomatin in modulating mechanosensitive ion channels : impact on red blood cell hydration defects

• Auteur / Autrice : Sarah Rougé
• Direction : Isabelle Mouro-Chanteloup
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Hématologie
• Date : Soutenance le 05/12/2022
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Hématologie, oncogenèse et biothérapies (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie intégrée du globule rouge (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Mariano Ostuni
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Mariano Ostuni, Hélène Guizouarn, Loïc Garçon, Laura Baciou
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Hélène Guizouarn, Loïc Garçon

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biomécanique

Canaux ioniques

Érythrocytes

Mots clés libres

Globule rouge

Canaux ioniques

Pannexine1

Piezo1

Mécanosensible

Stomatine

Red blood cell

Ion channel

Pannexin1

Piezo1

Mechanosensitive

Stomatin

Résumé

Le globule rouge (GR) humain possède une grande capacité à se déformer, pour s'adapter à divers stress, en particulier un stress mécanique, lors de son passage dans les capillaires et un stress osmotique, pour résister à la tonicité du milieu. Les canaux ioniques mécanosensibles à la membrane du GR constituent des acteurs majeurs de cette régulation par modulation indirecte de son contenu en eau. C'est le cas de Piezo1 et la Pannexine1 (PANX1) : le premier canal, quand il est stimulé, laisse entrer le calcium entrainant une perte d'eau par efflux de potassium via l'activation du canal potassique calcium-dépendant Gardos ; et le second canal, une fois activé, laisse sortir l'Adénosine TriPhosphate (ATP), permettant un gain d'eau par influx de sodium via l'activation du récepteur purinergique ATP-dépendant. Dans les neurones, une régulation des canaux mécanosensibles fait intervenir des protéines de la famille des stomatines. Or, la stomatine érythrocytaire, fortement exprimée dans des microdomaines membranaires riches en cholestérol, est absente des GRs de rares patients atteints de stomatocytose héréditaire à hématies hyperhydratées (OHSt). Bénéficiant de prélèvements sanguins de témoins et de 3 de ces patients, les travaux de cette thèse ont pour objectif l'étude des flux ioniques en présence et en absence de la stomatine, après stimulations de PANX1 et de Piezo1. Une invalidation par CRISPR Cas9 de l'expression de la stomatine à la membrane de cellules de la lignée érythroleucémique K-562 a également permis de confirmer les résultats obtenus sur GRs. Après vérification de la proximité de la stomatine avec la PANX1 et avec Piezo1 par Proximity Ligation Assay (PLA) in situ sur GRs, stromas et cellules K-562, nous avons démontré que 1) l'activation de PANX1 par élévation du potassium extracellulaire induit l'influx de la 5(6)-carboxyfluoresceine augmenté de 34% dans les GRs témoins (stom+) et de seulement 11% dans les GRs OHSt (stom-); dans les cellules K-562 stom+, l'influx de TO-PRO-3 est augmenté de 35.72% et de seulement 18.46% dans les cellules stom-, après stimulation mécanique de PANX1 ; 2) l'activation de Piezo1 avec son agoniste Yoda1 dans les GRs entraine dans les GRs OHSt une diminution de 57.38% de l'influx calcique par rapport aux GRs témoins. Cette diminution de l'activité des canaux ioniques PANX1 et Piezo1 serait donc corrélée à une perte de mécanosensibilité en absence de stomatine, celle-ci entrainant une déstabilisation des radeaux lipidiques et provoquant la perte partielle de rigidité de la membrane.

The human red blood cell (RBC) has a great capacity to deform, to adapt to various stresses, in particular mechanical stress, during its passage through capillaries and osmotic stress, to resist the tonicity of the environment. Mechanosensitive ion channels at the RBC membrane are major players in this regulation by indirect modulation of its water content. This is the case of Piezo1 and Pannexin1 (PANX1): the first channel, when stimulated, allows calcium influx leading to a loss of water by potassium efflux via the activation of the calcium-dependent potassium channel Gardos; and the second channel, when activated, allows the efflux of Adenosine TriPhosphate (ATP), leading to a gain of water by sodium influx via the activation of the ATP-dependent purinergic receptor. In neurons, a regulation of mechanosensitive channels involves proteins of the stomatin family. However, erythroid stomatin, highly expressed in cholesterol-rich microdomains of the membrane, is absent from the RBCs of rare patients with Overhydrated Hereditary stomatocytosis (OHSt). Using blood samples from controls and 3 of these patients, the aim of this thesis is to study the ionic fluxes in the presence and absence of stomatin, after PANX1 and Piezo1 stimulation. A CRISPR Cas9 invalidation of stomatin expression on the membrane of the erythroleukemia cell line K-562 also confirmed the results obtained on GRs. After verification of the proximity of stomatin to PANX1 and Piezo1 by in situ Proximity Ligation Assay (PLA) in GRs, stromas and K-562 cells, we demonstrated that 1) PANX1 activation by elevation of extracellular potassium induced the influx of 5(6)-carboxyfluorescein increased by 34% in control RBCs (stom+) and by only 11% in OHSt RBCs (stom-) and, in K-562 stom+ cells, TO-PRO-3 influx is increased by 35.72% and only 18.46% in stom- cells, after mechanical stimulation of PANX1; 2) activation of Piezo1 with its agonist Yoda1 in OHSt RBCs results in a 57.38% decrease in calcium influx compared to control RBCs. This decrease of PANX1 and Piezo1 ion channels activity would be correlated to a loss of mechanosensitivity in the absence of stomatin, which leads to a destabilization of lipid rafts and to a partial loss of membrane rigidity.