Description génomique de la différenciation des iPSC humaines en cellules musculaires lisses et application à l'évaluation de la régulation fonctionnelle de LRP1, un locus de risque génétique pléiotropique pour plusieurs maladies cardiovasculaires

Genomic depiction of human iPSC differentiation into smooth muscle cells and application to assess the functional regulation at LRP1, a pleiotropic genetic risk locus for several cardiovascular diseases

• Auteur / Autrice : Lu Liu
• Direction : Nabila Bouatia Naji
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance le 09/11/2022
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Paris Centre de Recherche Cardiovasculaire (Paris ; 2010-....)
• Jury : Président / Présidente : Alain Tedgui
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Alain Tedgui, Marie Luce Bochaton-Piallat, Albano Carlo Meli, Anne Joutel, Mathias Mericskay
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marie Luce Bochaton-Piallat, Albano Carlo Meli

Mots clés

Mots clés contrôlés

Myocytes du muscle lisse

Matrice extracellulaire

Locus génétiques

Étude d'association pangénomique

Génétique

Maladies cardiovasculaires

Mots clés libres

SMCs

IPSCs

Transcriptomique

ATAC-Seq

Protéomique

Locus pléiotropique

Capacité d'enhancement

Matrice extracellulaire

SMCs

IPSCs

Transcriptomic

ATAC-Seq

Proteomic

Pleiotropic locus

Enhancer capacity

Extracellular matrix

Résumé

Les maladies cardiovasculaires (MCV) héréditaires sont une cause majeure de morbidité et de mortalité. Les études génétiques de type GWAS ont grandement contribué à identifier de nombreux loci de prédisposition pour les MCV. Cependant, les mécanismes sous-jacents restent indéterminés. Le manque de modèles cellulaires humains pertinents a également limité l'étude des cellules artérielles, en particulier les cellules musculaires lisses (SMC), dont les caractéristiques phénotypiques spécifiques sont difficiles à étudier in vitro. Plusieurs GWAS ont décrit un signal d'association dans le gène LRP1 (low-density lipoprotein receptor-related protein 1), avec notamment la migraine, la fonction pulmonaire, la dysplasie fibromusculaire, la dissection de l'artère cervicale et la dissection spontanée de l'artère coronaire. La biologie des SMCs est centrale pour maintenir l'intégrité artérielle, qui est fréquemment altérée dans ces maladies, en particulier celles impliquant une dissection. Les objectifs de ma thèse étaient 1) de décrire les phénotypes cellulaires, épigénomiques et protéomiques de modèles de SMCs dérivés à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) et 2) d'utiliser ensuite ces modèles pour étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires dans le locus LRP1. J'ai d'abord mis en oeuvre deux protocoles de 24 jours utilisant soit RepSox (R-SMCs), un inhibiteur du TGF-ß, soit PDGF-BB et TGF-ß (TP-SMCs). Après validation de la présence de marqueurs SMC spécifique, j'ai constaté que les TP-SMCs présentaient une plus grande capacité de prolifération, de migration mais une plus faible libération de calcium en réponse à des stimuli contractiles par rapport aux R-SMCs. Les données RNASeq combinées à l'analyse de la chromatine accessible (ATAC)-Seq ont montré que FOXF1 et HAND1 sont les principaux facteurs de différenciation par RepSox. Les gènes impliqués dans la fonction contractile étaient fortement exprimés dans les R-SMCs par rapport aux TP-SMCs ou aux SMCs primaires. Les analyses du contenu de la matrice extracellulaire (ECM) par spectrométrie de masse ont montré une surexpression des protéines impliquées dans la réparation dans les TP-SMC et une sécrétion plus importante des constituants de la membrane basale par les R-SMC. Les régions de chromatine ouverte des R-SMCs et des TP-SMCs étaient significativement enrichies en variants associés aux maladies coronariennes et à la pression artérielle. La deuxième partie de ma thèse a été consacrée à l'étude fonctionnelle du locus LRP1. J'ai utilisé CRISPR/Cas9 pour supprimer une région génomique de 100pb centrée sur rs11172113, le variant estimé causal, et pour générer des génotypes homozygotes pour ce variant dans des iPSCs que j'ai ensuite différencié en TP-SMCs. Rs11172113 se trouvait dans une région enhancer qui affecte l'expression de LRP1 et qui est susceptible d'interagir avec les répresseurs de la transcription MECP2 et SNAI1, préférentiellement avec l'allèle C. La délétion de LRP1 a altéré les capacités de prolifération et de migration des cellules, mais n'a eu aucun impact sur les fonctions de contraction ou de libération de calcium. Les données RNA-seq ont indiqué que les gènes exprimés de manière différentielle dans les cellules knockout pour LRP1 étaient enrichis pour les fonctions liées à l'organisation et la structure de l'ECM. L'analyse protéomique a montré que ces cellules sécrétaient plus de SULF1, CYR61 et TIMP3, tous impliqués dans l'organisation de l'ECM. En résumé, mon travail de thèse a appliqué des méthodes épi-génomiques et protéomiques, combinées à des techniques d'édition de génome, afin de caractériser des modèles de SMCs dérivés de iPSCs très pertinents pour la fonction artérielle. Mes travaux ont également permis de mieux comprendre les mécanismes à l'origine de l'association génétique entre le locus LRP1 et plusieurs maladies artérielles et ainsi contribué, par une perspective génétique, à élucider la pathogenèse de ces maladies.

Heritable cardiovascular disease (CVD) remains a major cause of morbidity and mortality worldwide. Genome-wide association studies (GWAS) have hugely contributed to map numerous genomic risk loci for CVD, mostly located in non-coding regions. However, the underlying mechanisms of causative variants and target genes remain undetermined. The lack of relevant human cellular models has also limited the study of arterial cells, especially human smooth muscle cells (SMC), which specific phenotypic features are challenging to study in vitro. Several GWAS conducted for a wide range of vascular diseases reported an association signal in low-density lipoprotein receptor-related protein 1 gene (LRP1), including migraine, pulmonary function, fibromuscular dysplasia, cervical artery dissection, and spontaneous coronary artery dissection. SMCs biology is central to maintain arterial integrity, which is frequently impaired in these diseases, especially those involving arterial dissection. The main aims of my thesis were 1) to depict the cellular phenotypes, epigenomic and proteomic features of SMCs models derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs) after implementation of valid differentiation protocols, and 2) to leverage these models to study the underlying molecular and cellular mechanisms in the pleiotropic cardiovascular risk locus LRP1. I first implemented two 24-days protocols using either RepSox (R-SMCs), a TGF-ß inhibitor, or PDGF-BB and TGF-ß (TP-SMCs) to generate iPSCs derived SMCs. After validation of the presence of specific SMC markers, I found that TP-SMCs exhibited greater capacity of proliferation, migration and lower calcium release in response to contractile stimuli compared to R-SMCs. RNA-Seq data combined with assay for transposase accessible chromatin (ATAC)-Seq pointed at FOXF1 and HAND1 as key drivers of the RepSox differentiation program. I also found that genes involved in the contractile function were highly expressed in R-SMCs compared to TP-SMCs or primary SMCs. Analyses of extracellular matrix (ECM) contents using mass spectrometry supported an overexpression of proteins involved in wound repair in TP-SMCs and a higher secretion of basal membrane constituents by R-SMCs. Of note, open chromatin regions of R-SMCs and TP-SMCs were significantly enriched for genetic variants associated with coronary artery disease and blood pressure. The second part of my thesis was dedicated to the functional study of the LRP1 locus. I used CRISPR/Cas9 to delete a 100pb genomic region centered on rs11172113 and to generate homozygous genotypes for this variant in iPSC that I differentiated into TPSMCs. Rs11172113 lied in an enhancer region that affects LRP1 expression likely to interact with transcriptional repressors MECP2 and SNAI1, which we found to differentially bind to the C allele of rs11172113. LRP1 deletion impaired iPSC-SMCs capacities to proliferate and migrate, but had no impact on contraction or calcium release functions. RNA-seq data indicated that differentially expressed genes in LRP1 knockout iPSC-SMCs were enriched for functions related to extracellular matrix structure and organization. The analysis of secreted proteioms showed that LRP1 knockout cells secreted higher protein levels of SULF1, CYR61 and TIMP3, all involved in extracellular organization. In summary, my Ph.D. work applied cut-edging epigenomic, genomic and proteomic methods combined with gene editing techniques to characterize iPSC derived SMCs models with high relevance to arterial function. My work also provided new insights into the mechanisms behind the genetic association in LRP1 locus in relation to several arterial diseases and vascular tone regulation and contributed through a genetic perspective to elucidate the pathogenesis of CVD.