Facteurs impliqués dans l'assemblage du pseudopilus et dans la reconnaissance du substrat dans le système de sécrétion de type II chez Klebsiella

Pseudopilus assembly and substrate recognition factors in the Klebsiella type II secretion system

• Auteur / Autrice : Yuanyuan Li
• Direction : Olivera Francetic
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 16/12/2022
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité Biochimie des interactions macromoléculaires (Paris)
• Partenaire(s) de recherche : Structure de recherche : Institut Pasteur. Département de Biologie structurale et chimie (2006-….)
• Jury : Président / Présidente : Emmanuelle Bouveret
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Ombeline de La Rochefoucauld-Rossier, Nadia Izadi-Pruneyre
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Romé Voulhoux, Raffaele Ieva

Mots clés

Mots clés contrôlés

Systèmes de sécrétion de type II

Bactéries Gram négatives

Amylases

Klebsiella

Mots clés libres

Système de sécrétion de type II

Assemblage des piili

Interaction protéine-protéine

Signal de sécrétion

Klebsiella

Type II secretion system

Pseudopilus assembly

Secretion signal

Protein-Protein interactions

Klebsiella

Résumé

Les bactéries à Gram-négatif utilisent plusieurs mécanismes pour sécréter des protéines spécifiques à travers leur enveloppe vers la surface cellulaire ou le milieu. Chez Klebsiella, notre modèle expérimental, le système de sécrétion de Type II (SST2) permet la sécrétion de la pullulanase (PulA), une enzyme de la famille des amylases. La sécrétion de PulA repose sur l'assemblage de filaments périplasmiques appelés pseudopili qui facilitent le transport des substrats repliés du périplasme à travers la membrane externe. Les pseudopili, apparentés aux pili de type IV, sont composés de quatre sous-unités mineures (PulHIJK) et d'une sous-unité majeure, PulG. Ils sont polymérisés dans la membrane interne au niveau d'un sous-complexe de SST2 - la plateforme d'assemblage - composé de protéines PulF, PulL et PulM. Le mécanisme d'assemblage du pseudopilus et son rôle éventuel dans la reconnaissance du substrat restent mal compris. PulA est une lipoprotéine de 117 kDa sécrétée par le SST2 sous forme repliée. Dans ce travail, nous avons cherché à identifier les composants du SST2 qui interagissent directement avec PulA pour permettre sa sécrétion. Dans ce but, nous avons effectué une analyse systématique par l'approche du double hybride bactérien (BACTH), ainsi que par pontage chimique et co-purification. Nous avons également mis en place une approche de pontage in vivo après irradiation aux rayons UV grâce à l'acide aminé non naturel pBPA introduit dans les régions de PulA contenant des signaux de sécrétion potentiels. L'analyse par BACTH a identifié les composants de la plate-forme d'assemblage PulF et PulM, ainsi que les pseudopilines PulG, PulI et PulH, comme partenaires d'interaction putatifs de PulA. Dans la deuxième partie du travail, nous nous sommes intéressés aux composants de la plateforme d'assemblage PulL et PulM impliqués dans l'assemblage des pseudopili et dans la sécrétion de PulA. Ce travail a été réalisé en collaboration avec l'équipe de N. Izadi-Pruneyre, qui a déterminé la structure des domaines C-terminaux (CTD) de PulL et PulM et de leur interface dans le complexe. Nous avons construit des variants contenant des substitutions des résidus d'interface PulLCTD - PulMCTD et montré qu'ils sont déficients pour la sécrétion de PulA. Nous avons également étudié les interactions PulL - PulM par l'approche du BACTH et utilisé le pontage disulfure pour caractériser les interactions entre leurs segments transmembranaires. Ensemble, ces données nous ont permis de proposer un modèle structural du complexe PulL - PulM dans la membrane. Nos travaux ont révélé un ratio entre PulM et PulL dans la cellule de 20 :1 ce qui suggère un rôle dynamique de PulM dans le transfert de PulG, entre les molécules de PulG libre et celles de PulL associées au site actif d'assemblage du pseudopilus. Dans un second temps, nous avons étudié le rôle des hélices périplasmiques et des domaines cytoplasmiques de PulL et PulM dans leur assemblage. Nous avons constaté que la super-hélice formée entre leurs domaines périplasmiques joue un rôle clé dans la liaison PulL-PulM. Nous avons également constaté que le peptide N-terminal de PulM est nécessaire à la stabilité de PulL. Le même peptide interagit avec PulG, suggérant son rôle dans l'échange dynamique avec le domaine cytoplasmique de PulL. Ces résultats ouvrent la voie à des études plus détaillées sur des interactions et changements conformationnels impliqués dans les différentes étapes de l'extraction membranaire et incorporation de PulG dans le pseudopilus.

Gram-negative bacteria employ several types of complex machineries to secrete specific proteins across their cell envelope to the cell surface or to their milieu. The Klebsiella Type II secretion system (T2SS), our experimental model, is dedicated to secretion of pullulanase (PulA), an enzyme of the amylase family. PulA secretion relies on the assembly of periplasmic filaments called pseudopili, a process which is thought to drive the folded T2SS substrates from the periplasm across the outer membrane. Pseudopili, closely related to bacterial type IV pili, are composed of four minor tip subunits (PulHIJK) and a major core subunit PulG. They are polymerized at the inner membrane assembly platform subcomplex of the T2SS, composed of PulF, PulL and PulM inner membrane proteins. The mechanism of pseudopilus assembly and their role in substrate recognition are still poorly understood. PulA is a 117 kDa lipoprotein secreted in a folded form by the Klebsiella T2SS. In this work we aimed to identify T2SS components that interact directly with PulA to promote its transport across the outer membrane. Towards this goal, we performed systematic bacterial two-hybrid (BACTH) analysis, chemical cross-linking and co-purification. We also set up and in vivo UV crosslinking approach by introducing the unnatural amino acid pBPA in the PulA regions previously identified as putative secretion signals. The BACTH analysis identified the assembly platform components PulF and PulM as putative interacting partners of PulA, as well as the pseudopilins PulG, PulI and PulH. In the second part of the work, we focused on the assembly platform components PulL and PulM that promote pseudopilus assembly and PulA secretion. This work was done in collaboration with the team of N. Izadi-Pruneyre, who determined the structure of the C-terminal domains (CTDs) of PulL and PulM and of their complex. We tested mutations of residues mapping in the PulLCTD -and PulMCTD interface and found that they affect PulA secretion. We also investigated the interactions of full-length PulL and PulM by the BACTH approach and used cysteine crosslinking to map the interactions of PulL and PulM transmembrane segments. Together, these data allowed us to propose a structural model of the full-length PulL and PulM complex. The higher abundance of PulM compared to PulL revealed in our work suggested a dynamic role of PulM, which shuttles PulG monomers from their inner membrane pool to PulL at the pseudopilus assembly site. In a follow-up study, we investigated the role of periplasmic helices and cytoplasmic domains of PulL and PulM in their assembly. We found that the coiled-coil formed between periplasmic domains of PulL and PulM plays a key role in their binding. We also showed a new role of the PulM N-terminal peptide in PulL stability. The same peptide is required for binding to PulG, consistent with its role in a dynamic exchange with the cytoplasmic domain of PulL during pseudopilus assembly. These results open the way for more detailed investigation of interactions and conformational changes involved in different steps of membrane extraction and incorporation of PulG into the growing pseudopilus.