Approches d'édition de base pour le traitement des ß-hémoglobinopathies

Base editing approaches for the treatment of ß-hemoglobinopathies

• Auteur / Autrice : Giulia Hardouin
• Direction : Marina Cavazzana-Calvo
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biothérapies et biotechnologies
• Date : Soutenance le 05/12/2022
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Hématologie, oncogenèse et biothérapies (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Maladies Génétiques (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Carine Giovannangeli
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Carine Giovannangeli, Paula Río, John Strouboulis, Annarita Miccio, Mario Amendola
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Paula Río, John Strouboulis

Mots clés

Mots clés contrôlés

Thalassémie

Drépanocytose

Hémoglobinopathie

Thérapie génique

Mots clés libres

Thérapie génique

Beta-hémoglobinopathies

Drépanocytose

Beta-thalassémie

Édition de base

Gene therapy

Beta-hemoglobinopathies

Sickle cell disease

Beta-thalassemia

Base editing

Résumé

Les beta-hémoglobinopathies sont dues à des mutations affectant la synthèse ou la structure des chaînes de la beta-globine constituant l'hémoglobine adulte (HbA). La beta-thalassémie est une maladie récessive très répandue causée par des mutations dans le locus du gène de la beta-globine (HBB) qui réduisent (beta+) ou éliminent (beta0) la production de beta-globine. Les chaînes d'alpha-globine découplées précipitent et provoquent l'apoptose des précurseurs érythroïdes et une érythropoïèse inefficace. Selon le génotype, le phénotype clinique peut varier d'une anémie légère à une anémie dépendante des transfusions. La drépanocytose est causée par une mutation ponctuelle unique dans le gène HBB, qui entraîne la production d'une globine betaS défectueuse. Les tétramères d'Hb drépanocytaire (HbS) qui en résultent polymérisent sous hypoxie, déforment les globules rouges et provoquent une obstruction des micro-vaisseaux conduisant à une maladie chronique multi-organes. La transplantation de cellules souches/progénitrices hématopoïétiques (HSPCs) autologues génétiquement modifiées est une option thérapeutique intéressante. Cependant, les stratégies actuelles de thérapie génique basées sur l'utilisation de vecteurs lentiviraux ou de la nucléase CRISPR/Cas9 ne sont pas également efficaces chez tous les patients et/ou posent des problèmes de sureté. Les éditeurs de bases adénines (ABE), un outil d'édition du génome dérivé de CRISPR/Cas9, permettent l'insertion de mutations ponctuelles A>G à une position spécifique du génome. Les deux mutations beta0 CD39 (CAG>TAG) et IVS2-1 (G>A) et la mutation beta+ IVS1-110 (G>A) sont parmi les mutations beta-thalassémiques les plus courantes et les plus sévères de la région méditerranéenne et du Moyen-Orient. Nous avons exploité la capacité des ABEs en combinaison avec des ARN guides (gRNA) spécifiques pour corriger ces mutations. Pour chaque mutation, nos combinaisons ABE/gRNA ont permis d'obtenir des efficacités de correction allant jusqu'à ~90 % dans les HSPCs de patients atteints de beta-thalassémie. Les HSPC beta-thalassémiques modifiées ont été différenciées vers la lignée érythroïde pour évaluer la production de globine et d'Hb. Les globules rouges dérivés des HSPC modifiées ont présenté des niveaux élevés de beta-globine et une amélioration des ratios alpha/non-alpha globine. Le retard de différenciation érythroïde ainsi que le profil apoptotique et les niveaux élevés de stress oxydatif typiquement observés dans les cultures de cellules beta-thalassémiques ont été corrigés par notre traitement. Avec les éditeurs de bases actuels, la mutation T>A responsable de la drépanocytose ne peut pas être corrigée. Cependant, les ABEs peuvent convertir le A mutant en G (A>G). L'insertion de cette mutation crée un variant allélique connu de HBB, non pathogène, conduisant à la production de l'HbG-Makassar. Nous avons utilisé une lignée cellulaire portant la mutation SCD, SCD-HUDEP2, afin de sélectionner les combinaisons ABEs/gRNAs les plus performantes. Comme la mutation drépanocytaire était inaccessible avec la première génération d'ABEs, nous avons successivement modifié les domaines de l'enzyme et optimisé la longueur des gRNAs afin d'accéder au locus et d'augmenter l'efficacité de l'édition de bases sur la mutation. Ainsi, nous avons réussi à corriger jusqu'à ~80% des allèles dans des HSPCs de patient drépanocytaire. En conclusion, nous avons développé des approches efficaces d'édition de bases pour corriger trois mutations beta-thalassémiques sévères et hautement prévalentes ainsi que la mutation drépanocytaire. Les études de génotoxicité et la validation de ces résultats dans des HSPCs in vivo fourniront une preuve suffisante de sureté et d'efficacité pour permettre le développement clinique des stratégies par édition de bases des HSC pour la thérapie génique des beta-hémoglobinopathies.

Beta-hemoglobinopathies are caused by mutations affecting the synthesis or the structure of the beta-globin chain of the adult hemoglobin (HbA). Beta-thalassemia is a highly prevalent recessive disorder caused by mutations in the beta-globin gene (HBB) locus that reduce (beta+) or eliminate (beta0) beta-globin production. The uncoupled alpha-globin chains precipitate and cause apoptosis of erythroid precursors and inefficient erythropoiesis. Depending on the genotype, the clinical phenotype can vary from mild to transfusion-dependent anemia. Sickle cell disease (SCD) is caused by a single point mutation in HBB, which leads to the production of the defective betaS-globin. The resulting Hb tetramers (HbS) polymerize under hypoxia, deform red blood cells (RBCs) and cause micro vessels obstruction leading to a chronic multi-organ disease. Transplantation of autologous, genetically modified hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) is an attractive therapeutic option. However, current gene therapy strategies based on the use of lentiviral vectors or CRISPR/Cas9 nuclease are not equally effective in all the patients and/or raise safety concerns. Adenine base editors (ABEs), a CRISPR/Cas9-based genome editing tool, allow the insertion of A>G point mutations at a specific position. The two beta0 mutations CD39 (CAG>TAG) and IVS2-1 (G>A) and the beta+ mutation IVS1-110 (G>A) are among the most common and severe beta-thalassemia mutations in the Mediterranean area and Middle East. Here, we exploited the capacity of ABEs in combination with specific single guide RNAs (gRNAs) to correct these mutations. For each mutation, our ABEs/gRNAs combinations achieved correction efficiencies of up to ~90% in HSPCs from beta-thalassemia patients. Edited beta-thalassemic HSPCs were differentiated towards the erythroid lineage to evaluate globin and Hb production. RBCs derived from edited HSPCs exhibited high beta-globin levels and improvement of the alpha/non-alpha; globin ratios. The delayed erythroid differentiation as well as the apoptotic profile and elevated ROS levels typically observed in beta-thalassemic cell cultures were corrected by our treatment. Indeed, along the differentiation, we observed an increased enucleation rate compared to unedited beta-thalassemic controls, reaching the levels observed in healthy donor cells. With current base editors, the SCD-causing T>A mutation cannot be reverted. However, ABEs can convert the mutant A into a G (A>G). Insertion of this mutation creates a known non-pathogenic HBB allelic variant, leading to HbG-Makassar production. We used SCD-HUDEP2, a cell line carrying the SCD mutation, in order to select the best-performing ABEs/gRNAs combinations. As the SCD mutation was inaccessible with the first generation of base editors, we engineered ABE domains (deaminase, linker and Cas9) and optimized the gRNAs length in order to access the locus and increase base editing efficiencies at the target base. Finally, we achieved up to ~80% correction of the SCD mutation in SCD HSPCs. In conclusion, we developed efficient base editing approaches to revert three highly prevalent and severe beta-thalassemia mutations and the SCD mutation. Genotoxicity studies and validation of these results in HSPCs in vivo will provide sufficient proof of safety and efficacy to enable the clinical development of base-edited HSCs for gene therapy of beta-hemoglobinopathies.