Tolérance aux antibiotiques et formation de biofilm chez le symbiote intestinal anaérobie, bacteroides thetaiotaomicron

Antibiotic tolerance and biofilm formation in the anaerobic intestinal symbiont, bacteroides thetaiotaomicron

• Auteur / Autrice : Anne-Aurélie Lopes
• Direction : Jean-Marc Ghigo
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 26/10/2022
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Génétique des biofilms (Paris)
• Partenaire(s) de recherche : Structure de recherche : Institut Pasteur. Département de Microbiologie (2006-….)
• Jury : Président / Présidente : Isabelle Martin-Verstraete
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marie-Cécile Ploy, Philippe Langella
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Christiane Forestier, Muriel Masi

Mots clés

Mots clés contrôlés

Pompes d'efflux

Bactéroïdes

Biofilms

Flore intestinale

Mots clés libres

Microbiote intestinal

Biofilms

Bacteroides

Pompes à efflux

Tolérance aux antibiotiques

Gut microbiota

Biofilms

Bacteroides

Efflux pumps

Antibiotic tolerance

Résumé

Le microbiote intestinal humain impacte notre santé via son rôle dans les fonctions digestives, métaboliques, immunitaires et même neurologiques. Sa composition est dominée par les phyla Firmicutes et Bacteroidetes, dont l'un des membres les plus abondants est la bactérie commensale et strictement anaérobie Bacteroides thetaiotaomicron. Transmise de la mère à l'enfant, B. thetaiotaomicron favorise dès la période néonatale le développement de l'épithélium intestinal et du système immunitaire et joue ensuite un rôle clé dans la dégradation des polysaccharides complexes non métabolisables par l'hôte. En cas de déséquilibre du microbiote (dysbiose), provoqué par exemple par un traitement antibiotique, la baisse du contrôle assuré par les populations commensales en général, et par B. thetaiotaomicron en particulier, favorise l'implantation de pathogènes intestinaux tels que Clostridioides difficile, bactérie à l'origine de sévères diarrhées. Par ailleurs, la diminution de l'abondance des Bacteroides, dont B. thetaiotaomicron, est aussi corrélée à l'apparition de maladies intestinales inflammatoires chroniques et d'obésité. Alors que les communautés de bactéries intestinales adoptent un mode de vie proche du biofilm (communautés de bactéries agrégées entres elles), la formation de biofilm et la tolérance aux antibiotiques ont principalement été étudiées chez des bactéries pathogènes aérobies ou aérobies facultatives (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, etc.) en raison des préoccupations cliniques majeures qu'elles engendrent. Pourtant le biofilm et l'antibio-tolérance induite par les biofilms des bactéries commensales pourraient être impliqués dans plusieurs aspects bénéfiques importants, depuis la colonisation chez les nouveau-nés, jusqu'à la résilience aux dysbioses antibiotiques et ainsi contribuer à la prévention des infections secondaires opportunistes ou de certaines maladies inflammatoires chroniques. Lors de ma thèse, je me suis intéressée à la formation de biofilm chez B. thetaiotaomicron, tout d'abord en contribuant à une étude portant sur le rôle des sels biliaires dans l'induction de la formation de biofilm chez B. thetaiotaomicron et l'importance de la dégradation de l'ADN par une nucléase extracellulaire (BT3563). Je me suis ensuite intéressée au rôle potentiel des pompes à efflux dans la formation de biofilm. Après avoir montré que le phénylalanine-arginine ß-naphthylamide (PAßN), un inhibiteur global des pompes à efflux de type RND, inhibe la formation de biofilm dépendant des sels biliaires, j'ai réalisé un crible de ces pompes à efflux et mis en évidence le rôle de la pompe BT3337-39, dont l'expression est induite par la présence de sels biliaires, ainsi que du régulateur transcriptionnel, appartenant à la famille AraC, BT1847. J'ai ensuite mis en évidence le lien entre cette pompe, ce régulateur, la concentration extracellulaire en magnésium et le profil en ADN de la matrice extracellulaire. J'ai aussi démontré in vitro que la formation de biofilm entraîne une tolérance aux antibiotiques à des concentrations très élevées dans la souche de laboratoire VPI5482 mais aussi chez certains isolats cliniques formant du biofilm. L'implication de cette antibio-tolérance induite par le biofilm dans la limitation des dysbioses aux antibiotiques et les infections secondaires à C. difficile est actuellement testée en minibioréacteurs (MBRA), un système de culture in vitro qui permet de tester l'effet de l'antibio-tolérance de nos souches en présence de communautés microbiennes fécales complexes, ainsi que in vivo dans un modèle murin. Au-delà de ses aspects fondamentaux, ce projet pourrait, à terme, mener à la conception d'indicateurs prédictifs de dysbiose ou de stratégies raisonnées de conception de souches probiotiques de B. thetaiotaomicron, susceptibles de réduire l'impact négatif d'évènements dysbiotiques.

The human gut microbiota impacts our health through its role in digestive, metabolic, immune and even neurological functions. Its composition is dominated by the phyla Firmicutes and Bacteroidetes, of which one of the most abundant members is the commensal and strictly anaerobic bacterium Bacteroides thetaiotaomicron. Transmitted from mother to child, B. thetaiotaomicron promotes the development of the intestinal epithelium and immune system from the neonatal period and subsequently plays a key role in the degradation of complex polysaccharides that cannot be metabolised by the host. In the event of an imbalance in the microbiota (dysbiosis), caused for example by antibiotic treatment, the reduced control by commensal populations in general, and by B. thetaiotaomicron in particular, favours the establishment of intestinal pathogens such as Clostridioides difficile, a bacterium that causes severe diarrhoea. Furthermore, the decrease in the abundance of Bacteroides, including B. thetaiotaomicron, is also correlated with the onset of chronic inflammatory bowel diseases and obesity. While communities of intestinal bacteria adopt a biofilm-like lifestyle (communities of bacteria aggregated together), biofilm formation and antibiotic tolerance have been studied mainly in aerobic or facultative aerobic pathogenic bacteria (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, etc.) due to the major clinical concerns they generate. Yet, biofilm and antibiotic tolerance induced by gut commensal bacteria biofilms could be involved in several important beneficial aspects, from colonisation in neonates, to resilience to antibiotic dysbiosis and thus contribute to the prevention of secondary opportunistic infections or certain chronic inflammatory diseases. During my thesis, I was interested in B. thetaiotaomicron's biofilm formation, firstly by contributing to a study on the role of bile salts in the induction of its biofilm formation and the importance of DNA degradation by an extracellular nuclease (BT3563). I then investigated the potential role of efflux pumps in biofilm formation. After showing that phenylalanine-arginine ß-naphthylamide (PAßN), a global inhibitor of RND-type efflux pumps, inhibits bile salt-dependent biofilm formation, I performed a screen of these efflux pumps and highlighted the role of the BT3337-39 pump, whose expression is induced by the presence of bile salts, as well as the transcriptional regulator, belonging to the AraC family, BT1847. I then demonstrated the link between them, the extracellular magnesium concentration and the DNA profile of the extracellular matrix. I also demonstrated in vitro that biofilm formation leads to antibiotic tolerance at very high concentrations in the laboratory strain VPI-5482 but also in some biofilm-forming clinical isolates. The implication of this biofilm-induced antibiotic tolerance in the limitation of antibiotic dysbiosis and secondary C. difficile infections is currently being tested in minibioreactors (MBRA), an in vitro culture system that allows us to test the effect of the antibiotic tolerance of our strains in the presence of complex faecal microbial communities, as well as in vivo in a mouse model. Beyond its fundamental aspects, this project could, in the long term, lead to the design of predictive indicators of dysbiosis or reasoned strategies for designing probiotic strains of B. thetaiotaomicron, likely to reduce the negative impact of dysbiotic events.