Rôle des sites de clivages protéolytiques de la protéine de spicule du Coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2)

Role of proteolytic cleavage sites in the spike protein of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2)

• Auteur / Autrice : Stacy Gellenoncourt
• Direction : Lisa Chakrabarti
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Infectiologie
• Date : Soutenance le 15/04/2022
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Virus et Immunité
• Partenaire(s) de recherche : Structure de recherche : Institut Pasteur. Département de Virologie (2006-….)
• Jury : Président / Présidente : Sylvie Van der Werf
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Bruno Coutard, Pierre-Yves Lozach

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines de fusion virale

Glycoprotéine de spicule des coronavirus

Protéolyse

SARS-CoV-2 (virus)

Mots clés libres

SARS-CoV-2

Protéine spike

Clivage protéolytique

Fusion virale

Variants

SARS-CoV-2

Spike protein

Proteolytic cleavage

Viral fusion

Variants

Résumé

Récemment, la pandémie liée au SARS-CoV-2 a engendré une crise sanitaire mondiale. L'une des caractéristiques marquantes de ce virus est l'insertion d'un site de clivage polybasique pour la furine entre les deux sous-unités S1 et S2 de la protéine de surface spike. Le clivage du site S1/S2 régule l'entrée virale, en permettant la survenue d'un second clivage en S2' qui va libérer l'extrémité N-terminale du peptide de fusion. Il est d'autant plus important d'étudier le processus de clivage de la spike, sachant que les variants majeurs du SARS-CoV-2 tels qu'Alpha et Delta présentent des mutations proches du site S1/S2 qui modulent l'infectivité virale. Lors de cette étude, nous avons généré une série de spike mutées dans les sites S1/S2 et S2', qui ont été analysées pour leur capacité fusogène dans un test de fusion cellule-cellule, et pour leur effets sur l'infectivité dans un système de pseudotypes lentiviraux. Nous montrons que la délétion du site S1/S2 rend la spike non fusogène, mais que par contre les pseudotypes portant ces spikes mutantes restent infectieux sur des cellules HEK exprimant le récepteur ACE2, que le corécepteur TMPRSS2 soit présent ou non. Cette dissociation des deux phénotypes peut s'expliquer par l'utilisation d'une voie d'entrée endosomale dépendante des cathepsines par les pseudotypes. De façon intéressante, les mutants ne comprenant plus qu'une seule arginine en S1/S2 ne sont pas fusogènes sur cellules HEK-ACE2, mais le restent sur cellules HEK-ACE2-TMPRSS2, ce qui suggère que TMPRSS2 peut cliver la spike à la place de la furine lorsque qu'un caractère polybasique du site de clivage est perdu. Une analyse des particules de pseudotypes par western blot montre que la présence d'une séquence polybasique au S1/S2 limite l'incorporation de la spike, du fait du relargage de certaines des sous-unité S1 préclivées lors de la production des particules virales. La préactivation de la spike par clivage au site furine a donc pour contrepartie une instabilité accrue de ces particules, ce qui limite le pouvoir infectieux sur cellules HEK-ACE2. Les mutations P681H et P681R, portées respectivement par les variants Alpha et Delta, rendent le site S1/S2 encore plus basique et plus efficacement clivé, comme le montre l'analyse par Western blot. Cela se traduit par une capacité fusogène accrue, ce qui pourrait contribuer au pouvoir pathogène accru de ces variants. Nos recherches actuelles visent à caractériser les mutations stabilisatrices qui évitent une perte trop rapide de la sous-unité S1 préclivée, et permettent aux variants de conserver un fort pouvoir infectieux. De plus, nous analysons le degré de clivage dans des particules virales authentiques du SARS-CoV-2 et de ses variants, ceci dans un système plus physiologique d'infection en épithélium nasal humain reconstitué. Enfin, nous avons participé à une étude de protéomique par approche N-terminomics qui a permis d'identifier de nouveaux sites de clivages dans la spike au cours d'une infection par le SARS-CoV-2. Ces travaux ouvrent la perspective de comprendre le rôle de ces clivages additionnels, qui pourraient contribuer à un nouveau mécanisme de défense cellulaire par inactivation protéolytique des protéines virales entrantes.

The recent SARS-CoV-2 virus pandemic has led to a worldwide health crisis. A notable characteristic of this virus is the insertion of a polybasic cleavage site between the S1 and S2 subunits of the spike surface protein. The cleavage of the S1/S2 site regulates viral entry, by enabling a second cleavage event at the S2' site, which releases the fusion peptide N-terminus. Studying the spike cleavage process is all the more relevant considering that major SARS-CoV-2 variants, such as Alpha and Delta, harbor mutations close to the S1/S2 site that modulate viral infectivity. In this study, we generated a series of spikes mutated at the S1/D2 and S2' sites, which were analyzed for their fusogenic capacity in a cell-cell fusion assay and for their effects on infectivity in a pseudotyped lentivirus system. We show that deletion of the S1/S2 site makes the spike non-fusogenic, while pseudotypes carrying these mutant spikes remain infectious in HEK cells expressing the ACE2 receptor, whether the TMPRSS2 coreceptor is expressed or not. The discinnect between these two phenotypes can be explained by the pseudotypes using an endosomal route of entry dependent of cathepsin proteases. Interstingly, mutants having a single arginine left at the S1/S2 site are not fusogenic on HEK-ACE2 cells, but remain so on HEK-ACE2-TMPRSS2 cells, suggesting that TMPRSS2 can cleave the spike instead of furin when the polybasic sequence is missing from the cleavage site. Analysis of pseudotyped viruses by Western blot shows that presence of a polybasic sequence at the S1/S2 site limits spike incorporation, due to the shedding of a part of the S1 subunits pre-cleaved upon viral particle production. The preactivation of the spike by proteolytic cleavage at the furin site is thus counterbalanced by an increased instability of viral particles, that limits their infectivity in HEK-ACE2 cells. The P681H and P681R mutations, carried by the Alpha and Delta variants, respectively, make the S1/S2 site even more basic and more efficiently cleaved, as shown by Western blotting. This results in an increased fusogenic capacity, which may contribute to the increased pathogenic potential of these variants. Our current research aims at characterizing the stabilizing mutations that prevent a too rapid shedding of the precleaved S1 subunit, thus allowing the variants to maintain a high infectious potential. In addition, we are characterizing the extent of cleavage in authentic viral particles from SARS-CoV-2 and its variants, using a more physiological system of infection in a reconstructed human nasal epithelium. Last, we contributed to a proteomics study relying on N-terminomics that identified new spike cleavage sites generated during SARS-CoV-2 infection. This work opens the possibility of elucidating the role of these additional cleavage sites, which may contribute to a new cellular defense mechanism based on the proteolytic inactivation of entering viral proteins.