Dégradation des acides gras exogènes chez Escherichia coli

Degradation of exogenous fatty acids in Escherichia coli

• Auteur / Autrice : Viola Pavoncello
• Direction : Frédéric Barras, Emmanuelle Bouveret
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 04/07/2022
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Adaptation au stress et Métabolisme chez les Entérobactéries
• Partenaire(s) de recherche : partenaire de recherche : Institut Pasteur
• Jury : Président / Présidente : Ivo Gomperts Boneca
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Ivo Gomperts Boneca, Mireille Ansaldi, Paolo Landini, Alexandra Gruss
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Mireille Ansaldi, Paolo Landini

Mots clés

Mots clés contrôlés

Entérobactéries

microbiologie

Acides gras

Escherichia coli

Mots clés libres

Acides gras

Β-oxydation

Régulation des gènes

Escherichia coli

Fe-S cluster

Fatty acid

Β-oxidation

Genetic regulation

Escherichia coli

Fe-S cluster

Résumé

Les entérobactéries sont capables d'utiliser des acides gras (AG) exogènes comme sources uniques de carbone et d'énergie. Après leur import dans la cellule, les AG sont les substrats des enzymes de dégradation des AG (Fad) du cycle de B-beta;-oxydation. Chez E. coli, en plus de la machinerie FadDEBA canonique, un deuxième groupe d'enzymes FadIJK a été proposé pour fonctionner spécifiquement en anaérobiose. Caractériser une telle B-oxydation en anaérobiose est important pour la compréhension du métabolisme des entérobactéries dans l'intestin. Cependant, depuis les premières observations en 2003, aucune autre étude n'a été menée. Le premier objectif de la thèse était de caractériser le deuxième système Fad et d'identifier les composants manquants. Les gènes ydiO et ydiQRST ont été proposés pour coder respectivement une déshydrogénase anaérobie et une chaîne de transfert d'électrons reliant le cycle de B-oxydation à la chaîne respiratoire. Cependant, nous n'avons pu mettre en évidence aucun phénotype dans la dégradation des AG qui seraient causés par la délétion de ces gènes. De plus, la surproduction de YdiO n'a pas restauré la croissance d'un mutant fadE sur AG +/-O2, et l'acyl-CoA synthase putative anaerobique FadK n'a pas non plus complémenté un mutant fadD. Nous avons ensuite étudié l'implication des facteurs transcriptionnels répondant à la présence d'oxygène ou de la source de carbone disponible. Nous avons montré que l'expression de fadIJ est régulée exactement comme celle des gènes fadDEBA, et surtout que fadIJK ne sont pas induits en -O2. Tous nos résultats montrent donc que les enzymes FadKIJ ne sont pas spécifiques pour la dégradation des AG en -O2, et que YdiO et YdiQRST ne sont pas impliqués dans ce métabolisme. Cependant, nous avons confirmé que FadIJ jouaient un rôle accessoire dans le métabolisme des AG, qui reste à être compris. Un deuxième aspect de la thèse était d'étudier l'enzyme auxiliaire FadH, essentielle pour dégrader les AG poly-insaturés tels que le linoléate. Puisque FadH contient un cluster Fe-S, nous avons supposé que la dégradation des AG dépendant de FadH pourrait être sensible à la carence en fer. En effet, la croissance de la souche sauvage d'E. coli en carence en fer est altérée spécifiquement sur linoléate. De plus, des enzymes eucaryotes effectuant la même réaction que FadH, mais dépourvues du cluster Fe-S, peuvent sauver la croissance de E. coli sur linoléate en carence en fer. Ces résultats ont été complétés par une approche de mutagenèse pour étudier le rôle du cluster Fe-S dans la fonction de FadH et le mécanisme de complémentation par les enzymes eucaryotes. La troisième partie de la thèse concerne la caractérisation du régulateur transcriptionnel YdiP et de son régulon. Le gène ydiP se trouve dans un locus de gènes potentiellement impliqués dans différents aspects du métabolisme carboné : la conversion du shikimate en chorismate, pour la synthèse d'acides aminés aromatiques et de quinones (ydiLMNB-aroD), et une voie alternative potentielle de dégradation des AG (ydiFOP-ydiQRSTfadK). Une analyse transcriptomique a permis de montrer que les gènes ydiLMNBaroD et ydiFO, situés en amont de YdiP, sont fortement induits lors de la surproduction de YdiP. Les données transcriptomiques ont été confirmées aux niveaux transcriptionnel et traductionnel. Tous ces gènes sont transcrits en opéron à partir d'un promoteur unique situé devant ydiL, et activé par YdiP. De plus, par une stratégie de recherche de mutations suppresseurs, nous avons montré que le locus est réprimé par H-NS, suggérant un mécanisme d'anti-silencing de H-NS par YdiP. En parallèle, la caractérisation de la protéine YdiP a permis d'identifier les résidus cruciaux pour sa fonction. De façon intéressante, le régulon de YdiP présente de nombreuses ressemblances avec celui de dégradation de la carnitine, ce qui suggère un rôle du régulon YdiP dans une voie catabolique spécifique mais du même type.

Enterobacteria can use exogenous fatty acids (FA) as unique carbon and energy sources. After FA are imported within the cell, they are the substrates of FA degradation (Fad) enzymes of the B-oxidation cycle. In E. coli, in addition to the well-known Fad machinery (FadDEBA), a second set of Fad enzymes (FadIJK) was proposed to work specifically in anaerobiosis. The possibility of B-oxidation in the absence of oxygen is intriguing, and its study can contribute to understanding Enterobacteria metabolism in the gut. However, since the initial observations in 2003, no further studies have been conducted on the subject, and several issues remain unsolved. The first goal of the thesis was to fully characterize the second Fad system and identify its missing components. The ydiO and ydiQRST genes were proposed to encode respectively a potential anaerobic dehydrogenase and an electron transfer chain linking the B-oxidation cycle with the respiratory chain. However, we did not find any phenotypes in FA degradation caused by the deletion ydiO or ydiQRST genes. Furthermore, YdiO overproduction did not rescue the growth of a fadE mutant on FA +/-O2, and the putative anaerobic acyl-CoA synthase FadK did not either rescue a fadD mutant. Then, we investigated the interplay of transcriptional factors responding to the presence of oxygen or the available carbon source. We showed that fadIJ expression is regulated exactly as the fadDEBA genes, and especially fadIJK are not induced in -O2. All our data reveal that FadKIJ are not specifically in charge of FA degradation in -O2, and that YdiO and YdiQRST are not involved in FA metabolism. However, we did confirm that FadIJ enzymes play an accessory role in FA metabolism, that remains to be fully understood. A second aspect of the thesis was to study the FadH auxiliary enzyme specifically required to degrade poly-unsaturated FAs such as linoleate. Because FadH carries an Fe-S cluster, we made the hypothesis that FA degradation relying on FadH may be sensitive to iron starvation. Indeed, we found that the growth of wild type E. coli on linoleate in iron starvation condition is impaired. We further showed that eukaryotic enzymes performing the same reaction as FadH, but lacking the Fe-S cluster, can rescue E. coli growth on linoleate in iron starvation condition. We completed these results by a mutagenesis approach to study the role of the Fe-S cluster in FadH function and the mechanism of complementation by the eukaryotic counterparts. The third part of the thesis concerns the characterization of the AraC-like transcriptional regulator YdiP and its regulon. The ydiP gene lies inside a locus of genes proposed to be involved in different aspects of carbon metabolism: conversion of shikimate to chorismate, which leads to aromatic amino acid and quinone production (ydiLMNB-aroD), and a putative alternative fatty acid degradation pathway (ydiFOP-ydiQRSTfadK). However, this cluster is poorly characterized, and the operon organization is not known. A transcriptomic analysis led to the identification of genes strongly increased upon YdiP overproduction, which are the ydiLMNBaroD and the ydiFO genes, located upstream ydiP. Further analyses confirmed the transcriptomic data at both transcriptional and translational levels. All these genes are found to be transcribed in operon from a single promoter located upstream ydiL, activated by YdiP. Also, via a suppressor mutation strategy, the nucleoid-associated regulator H-NS was found to repress the locus, suggesting a mechanism of H-NS anti-silencing by YdiP. In parallel, the characterization of YdiP protein features permitted the identification of some crucial residues for its biological function. Interestingly, the ydiP regulon shows similarities with the carnitine degradation genes, which together with the observed anaerobic induction of ydiP, suggest a role of this locus in a specific catabolic pathway in -O2.