Préparation d'un antidote neutralisant les anticoagulants oraux directs anti-FXa

Design and study of a reversal agent for FXa direct oral anticoagulants

• Auteur / Autrice : Johan Abdoul
• Direction : Sophie Gandrille
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Hématologie
• Date : Soutenance le 08/04/2022
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Innovations Thérapeutiques en hÉMostase (Paris ; 2006-....)
• Jury : Président / Présidente : Delphine Borgel
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Isabelle Gouin-Thibault, Elsa Bianchini
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Delphine Borgel, Philippe Nguyen

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines recombinées

Antidotes

Anticoagulants oraux directs

Mots clés libres

Anticoagulant oral direct

Facteur X

Antidote

Alpha2-Macroglobuline

Protéine recombinante

Direct oral anticoagulant

Factor X

Reversal agent

Alpha2-Macroglobulin

Recombinant protein

Résumé

En France, ce sont presque 2 millions de sujets âgés de plus de 65 ans qui sont traités actuellement par un anticoagulant classique ou, par un anticoagulant oral (AOD) qui cible spécifiquement un facteur de la coagulation, thrombine ou facteur Xa (FXa). Les plus utilisés sont les inhibiteurs directs du FXa, ou Xabans, amenés à supplanter les anticoagulants traditionnels. Or, si ces Xabans présentent des avantages indéniables par rapport aux anticoagulants traditionnels, ils exposent néanmoins à un risque hémorragique pour lequel il n'existe à l'heure actuelle pas d'antidote autorisé qui soit d'utilisation sécure. Ceci peut s'avérer dramatique en cas d'hémorragie, traumatisme ou de nécessité de chirurgie urgente chez un patient recevant ces Xabans. Faute d'antidote disponible, une molécule a obtenu une AMM de la FDA aux USA. C'est un leurre du FX, mais il présente l'inconvénient majeur d'entraîner un état prothrombotique du fait qu'il capte les inhibiteurs naturels de la coagulation, antithrombine (AT)et TFPI, faisant basculer l'équilibre hémostatique vers un état procoagulant se traduisant chez 10% des sujets traités par des complications thrombotiques. Des travaux réalisés dans l'Unité INSERM où j'ai réalisé ma thèse ont apporté la preuve de concept qu'il est possible de concevoir un antidote possédant les 3 propriétés indispensables pour une efficacité et une utilisation sécure : 1/ neutraliser n'importe quel Xaban (et ce malgré l'hétérogénéité de structures de ces molécules), 2/ ne pas conférer de risque thrombotique, et 3/ ne pas empêcher d'évaluer l'état hémostatique du sujet le recevant. L'antidote alors conçu et breveté consiste en un complexe de FXa dépourvu de domaine GLA (GDL-FXa) avec l''2-macroglobuline ('2-MG). Le GDL-FXa séquestré par l''2-MG n'interagit plus avec ses ligands macromoléculaires (Prothrombine, FVa, AT et TFPI') tout en laissant accessible le site de liaison aux Xabans. Bien qu'utilisable in vivo, cet antidote est trop complexe pour être facilement préparé. De façon intéressante, il s'est avéré également capable de neutraliser d'autres anticoagulants que les Xabans. Une forme d''2-MG modifiée chimiquement et structurellement similaire à l''2-MG du complexe '2- MG/GDL-FXa s'est avérée posséder les mêmes propriétés fonctionnelles, et la première partie de mon travail a consisté à étudier cette forme d''2-MG pour comprendre son interaction avec les autres anticoagulants. Mais l'essentiel de mon travail a consisté à concevoir un nouvel antidote universel des Xabans, de préparation plus simple que le complexe étudié. L'approche choisie a été celle d'une molécule qui fonctionne comme un « leurre », un FX recombinant modifié (rFX*) qui, une fois activé en rFXa*, est reconnu par n'importe quel Xaban comme étant sa cible, le capte très rapidement, tout en étant dépourvu d'activité thrombotique par suppression de son interaction avec ses inhibiteurs naturels. En s'appuyant sur la structure cristallographique du complexe de FXa/AT, différentes régions du FXa ont été choisies pour être modifiées afin d'abolir cette interaction, tout en laissant l'accès du sillon catalytique aux Xabans. Plusieurs types de modifications ont été testés. L'introduction d'un fort encombrement stérique, puis des modifications des boucles de surface interagissant avec l'AT se sont avérées empêcher l'expression cellulaire du rFX*. Des modifications plus subtiles ont alors été testées, et l'une d'elles a permis d'obtenir un rFX* exprimé aussi bien qu'un FX de type sauvage, qui une fois activé en rFXa* est capable de capter les Xabans, mais qu'aucun de ses deux inhibiteurs naturels, AT et TFPI, n'est capable d'inhiber. Ce rFXa* a été caractérisé d'un point de vue enzymatique et testé in vitro. Les résultats de ces études montrent qu'il est un candidat très prometteur pour un antidote universel des Xabans.

Almost two millions of French people aged 65 and more are treated by a traditional anticoagulant, or, more and more frequently now, by an oral anticoagulant targeting a single coagulation factor, thrombin or FXa. Direct inhibitors of FXa, or Xabans, are the most commonly used, and are proned to supplant traditional anticoagulants soon. However, while these Xabans undeniably present advantages over the traditional anticoagulants, they nevertheless encompass haemorrhagic risk to patients, and there is currently no safe antidote authorized. This can be critical in case of accident, emergency surgery, or unanticipated invasive exam. To overcome the lack of antidote, the use of a molecule has been authorized by the FDA in USA. This molecule is a FX decoy but its main drawback is that it induces a prothrombotic status because it binds the natural inhibitors of coagulation, antithrombin (AT) and Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI), leading to an inhibitor depletion that shifts the haemostasis balance toward a procoagulant status, and thus provokes thrombotic complications, some of which are fatal, in 10% of the subjects treated. Previous work performed in the INSERM Unit where I completed my thesis has provided proof of concept that it is possible to design an antidote exhibiting the 3 properties required for an efficient and safe use: 1/ being able to neutralize any Xaban (and this, despite the structural heterogeneity of these molecules), 2/ do not confer thrombotic risk, and 3/ do not preclude to evaluate the hemostatic state of the subject receiving it. The patented antidote designed consists of a complex of Gla-domainless FXa (GDL-FXa) with alpha2-macroglobulin (A2-M). GDL-FXa sequestered by A2-M no longer interacts with its macromolecular ligands (Prothrombin, FVa, AT and TFPI...) while leaving the Xabans binding site accessible. This patented antidote can be used in vivo, but its preparation is long and difficult to achieve. Interestingly, it has also proven to be able of neutralizing anticoagulants other than Xabans. A chemically modified A2-M being structurally similar to the A2-M of the A2-M/FXa complex was found to have the same functional properties, and the first part of my work was to study this form of A2-M in order to understand its ability to interact with anticoagulants other than Xabans. But the most important part of my work was devoted to the design of a new universal antidote for Xabans that was easier to prepare than the A2-M/FXa complex. The approach chosen was that of a molecule that functions as a «decoy», a recombinant FX modified (rFX*) by site-directed mutagenesis so that, once activated into rFXa*, it is recognized by any Xaban as its target, it captures it very quickly, while being devoid of thrombotic activity thanks to abolishion of its interactions with its natural inhibitors. Based on the crystal structure of the FXa/AT complex, different parts of the FXa were chosen to be modified to eliminate this interaction, while leaving access to the catalytic grove and the binding sites of the Xabans. Several types of modifications have been tested. We tested the introduction of a steric hindrance, as well as changes in the surface loops interacting with the AT, but all these modifications proved to prevent the cellular expression of rFX*. Thus, we tested more subtle modifications, and one of them resulted in a rFX* expressed as efficiently as wild-type FX, and that, once activated into rFXa*, was able to capture Xabans, but that none of its two natural inhibitors, AT and TFPI, was able to inhibit. This rFXa* was enzymatically characterized and tested in vitro. The results of these studies evidenced that it is a very promising candidate for a universal antidote to the Xabans.