Étude du mécanisme d'efflux des pompes MexAB-OprM et MexXY-OprM chez Pseudomonas aeruginosa, pathogène multirésistant présent dans les poumons de patients mucoviscidose.

Efflux mecanisms study of MexAB-OprM and MexXY-OprM efflux pumps from Pseudomonas aeruginosa, multiresistant pathogene in lungs of patients with kystic fibrosis

• Auteur / Autrice : Margaux Lustig
• Direction : Isabelle Broutin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale
• Date : Soutenance le 18/02/2022
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Cibles thérapeutiques et conception de médicaments (Paris ; 2019-....)
• Jury : Président / Présidente : Martin Picard
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Martin Picard, Jean-Michel Bolla, Andréa Dessen, Laetitia Daury
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Michel Bolla, Andréa Dessen

Mots clés

Mots clés contrôlés

Mucoviscidose

Peptidoglycanes

Aminosides

Biochimie

Pompes d'efflux

Pseudomonas aeruginosa

Mots clés libres

Pseudomonas aeruginosa

MexAB-OprM

MexXY/OprM

Pompes à efflux

Biologie structurale

Biochimie

Aminosides

Peptidoglycane

Test d'efflux

Pseudomonas aeruginosa

MexAB-OprM

MexXY/OprM

Efflux pumps

Structural biology

Biochemistry

Aminosides

Peptidoglycane

Efflux assays

Résumé

Pseudomonas aeruginosa, bactérie à Gram négatif, est un pathogène opportuniste, responsable de près de 10% des infections nosocomiales. Elle infecte également les poumons de patients atteints de mucoviscidose où elle devient prépondérante au fur et à mesure des traitements antibiotiques. Sa pathogénicité et sa virulence, associées à sa résistance naturelle aux antibiotiques, font de cette bactérie un problème sanitaire majeur, raison pour laquelle l'OMS l'a classé en 2017 comme une des priorités n°1 mondiale dans la découverte de nouveaux antibiotiques. Parmi les divers mécanismes développés par les bactéries pour résister aux antibiotiques, nous nous sommes intéressés au mécanisme d'efflux actif, et plus spécifiquement aux pompes à efflux de la famille des transporteurs RND (Resistance-Nodulation-Division). Il s'agit d'un assemblage macromoléculaire constitué d'un transporteur (RND) trimérique inséré dans la membrane interne, un canal (OMF) trimérique dans la membrane externe, et une protéine de fusion/adaptatrice (MFP) hexamèrique située dans le périplasme. Chez P. aeruginosa il existe plusieurs gènes codant pour des pompes d'efflux, quatre ayant été montrées comme impliquées dans la résistance aux antibiotiques. Mon projet de thèse portait sur l'étude de deux d'entre elles, MexAB-OprM et MexXY/OprM. La pompe MexAB-OprM est la mieux décrite. Elle est exprimée de manière constitutive au sein de la bactérie, et est capable d'effluer une large gamme de molécules allant de l'antibiotique au détergent. Néanmoins, des questions restent ouvertes sur le mode d'assemblage, et sur le rôle des différents constituants membranaires, notamment le peptidoglycane. Lors de ma thèse, nous avons réussi à montrer que le peptidoglycane, polymère présent dans l'espace périplasmique, jouait un rôle important dans la stabilisation de l'édifice. La pompe MexXY-OprM est, quant à elle, la seule pompe chez P. aeruginosa qui soit capable d'effluer les antibiotiques de la classe des amino(glyco)sides, largement utilisés en clinique, ce qui en fait une cible d'étude intéressante. Après avoir optimisé le protocole de production de MexY et de MexX, j'ai essayé de résoudre la structure du transporteur afin de mieux comprendre les mécanismes et les particularités qui régissent l'efflux des aminosides. J'ai utilisé en parallèle les techniques de cristallographie et de (cryo-) microscopie électronique (en collaboration avec le Dr. Olivier Lambert, CBMN, Bordeaux). Malgré des résultats encourageants obtenus pour les deux approches, des optimisations restent nécessaires afin de permettre cette étude structurale. Le dernier volet de ma thèse était la mise au point d'un test fonctionnel afin de cribler des molécules capables d'inhiber l'efflux des pompes MexAB-OprM et MexXY/OprM, que ce soit en bloquant les sites d'accès des antibiotiques ou en déstabilisant l'architecture de la machinerie. Pour ce faire, nous suivons la capacité d'efflux de différentes souches de P. aeruginosa, la souche originelle et des souches délétés des gènes codant pour les pompes d'intérêt, par mesure de fluorescence de substrats spécifiques. Différents protocoles ont été testés. Celui qui a été retenu utilise le Nile Red comme rapporteur d'efflux. Il a été optimisé pour la bactérie Escherichia coli, cependant, des optimisations sont encore nécessaires pour être fonctionnel pour la bactérie Pseudomonas aeruginosa. Des essais préliminaires de ce protocole avec des molécules potentiellement inhibitrices ont été effectués chez E. coli transformée avec des plasmides portant les gènes codant pour les pompes de P. aeruginosa que nous étudions. Certaines de ces molécules, développées par nos collaborateurs, sembleraient avoir un effet sur l'efflux, même si cela doit être confirmé.

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative opportunistic pathogen, responsible for almost 10% of nosocomial infections. It also infects the lungs of patients suffering of cystic fibrosis and becomes dominant after several years of antibiotics treatments. Its pathogenicity and virulence, associated to its natural resistance to antibiotics, make it a major health problem. That's why, in 2017, WHO classified P. aeruginosa as one of the n°1 worldwide priority pathogen for the discovery of new antibiotics. Among the different antibiotic resistance mechanisms developed by the bacteria, we investigate the active efflux via efflux pumps belonging to the RND (Resistance-Nodulation-Division) family. These pumps are macromolecular assemblies constituted of a trimeric transporter (RND) at the inner membrane, a trimeric channel (OMF) at the outer membrane and a hexameric fusion protein in the periplasmic space, making the link between the two others. In the Pseudomonas aeruginosa genome, several genes code for efflux pumps, four known to be involved in antibiotics resistance. My PhD project was about two of these efflux pumps, MexAB-OprM and MexXY/OprM. MexAB-OprM is the best described efflux pump. It is the only pump constitutively expressed in P. aeruginosa and it is able to extrude a large panel of molecules from antibiotics to detergents. Nevertheless, the mode of assembly, or the role of the different membranous components, especially peptidoglycan, remain an open question. During my PhD, we succeeded in demonstrating the essential role of the peptidoglycan in the stabilization of the macromolecular assembly. MexXY/OprM is, as for it, the only pump in P. aeruginosa able to extrude aminosides, a family of antibiotics largely used in clinic. It makes it an interesting target. After optimization of MexY and MexX production, I tried to elucidate the transporter structure in order to understand the mechanisms that allow the extrusion of aminosides. I used two technics in parallel, crystallography and (cryo-) electron microscopy (in collab with Dr. Olivier Lambert at CBMN, in Bordeaux). Despite promising results obtained with both approaches, optimizations are still necessary to allow the structural study. The last part of my project is the development of a functional test in order to screen molecules able to inhibit MexAB-OprM and/or MexXY/OprM, by blocking the access sites of antibiotics or disturbing the assembly of the pump. For this, we investigated the efflux capacity of different P. aeruginosa strains (wild-type and mutants deleted from the genes coding the pumps) by monitoring the fluorescence of specific substrates. Nile Red was retained as a good reporter of the efflux. The protocol was optimized for E. coli, but optimizations are still necessary to apply it to P. aeruginosa. Preliminary assays with potential inhibitors have been performed in E. coli C43 transformed with plasmids coding for the specific P. aeruginosa pumps we are studying. Several molecules, developed by collaborators, appear to be effective but it has to be confirmed.