Caractérisation de l’impact de la rigidité de la matrice extracellulaire sur les programmes transcriptionnels et épigénétiques

Characterisation of extracellular matrix stiffness impact on transcription and epigenetic programs

• Auteur / Autrice : Alexia Pigeot
• Direction : Jean-Christophe Andrau, Cyril Esnault
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 21/11/2022
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier
• Jury : Président / Présidente : Anne-Marie Martinez
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Christophe Andrau, Cyril Esnault, Anne-Marie Martinez, Kerstin Bystricky, Frédéric Beckouët, Anna Mattout, Matthieu Piel
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Kerstin Bystricky, Frédéric Beckouët
• DOI : 10.70675/aeec58bbz3cd1z485bz9018zccbe81ef0377

Mots clés

Mots clés contrôlés

Mécanotransduction cellulaire

Épigénomique

Matrice extracellulaire

Matrice extracellulaire

Épigénétique

Transduction du signal cellulaire

Transcription

Mots clés libres

Transcription

Domaines associés topologiquement (TADs)

Domaines associés à la lamine (LADs)

Mécanotransduction

Epigénétique

Matrice extracellulaire

Transcription

Topologically Associating Domains (TADs)

Lamina Associating Domains (LADs)

Mechanotransduction

Epigenetics

Extracellular matrix

Résumé

Les cellules répondent à leur environnement par le biais de signaux solubles et mécaniques. La rigidité de la matrice extracellulaire (ECM) induit l’engagement des cellules souches mésenchymateuses (MSC) dans une voie de différenciation spécifique et promeut l’invasion des cellules cancéreuses ainsi que l’activation des fibroblastes associés au cancer. La mécanotransduction est le mécanisme par lequel les cellules vont percevoir le signal mécanique à la membrane plasmique et le transmettre jusqu’au noyau par le biais du cytosquelette et du complexe LINC. A l’échelle de la cellule, ceci induit une modification de l’expression de la lamine A/C et participe à l’activation de voies de signalisation telles que YAP/TAZ et SRF/MRTF. Toutefois, par quels mécanismes ces modifications influencent l’organisation du génome, le paysage chromatinien et l’expression des gènes restent largement méconnus. Pour répondre à ces interrogations, nous avons utilisé des hydrogels mimant des rigidités retrouvées in vivo au sein des tissus : un souple à 0.5kPa et un rigide à 50kPa.Ainsi, dans une première étude, nous avons caractérisé comment les signaux mécaniques influencent l’organisation du génome, l’accessibilité de la chromatine, les marques d’histone associées aux régions actives et répressives du génome ainsi que les programmes d’expression géniques à l’aide de diverses techniques de génomique : le Hi-C, le ChIP-seq, le Cut&Run, le RNA-seq et l’ATAC-seq dans des fibroblastes primaires (BJ). Nous avons caractérisé environ 5000 gènes différentiellement exprimés entre nos deux conditions de culture et réalisé un atlas des enhancers putatifs. Le génome est organisé en domaines associés topologiquement (TAD) au sein desquels les interactions promoteur-enhancer sont favorisées. Ces mêmes TADs sont à leur tour retrouvés dans les compartiments A et B qui regroupent, respectivement, les TADs actifs et inactifs. Alors que les TADs ne semblent pas être impactés de façon majeure, nous observons des régions relocalisées entre les compartiments en réponse à la rigidité de l’ECM. La lamine nucléaire est impliquée dans l’organisation du génome par le biais des domaines associés à la lamine (LAD). Bien que la rigidité conduise à son remodelage, les régions chromatiniennes associées à la lamine B1 sont quant à elles largement conservées. Nous avons également identifié un groupe de gènes apparaissant comme bivalents dans les deux conditions de culture, mais spécifiquement exprimés en condition souple, et avons découvert grâce à des études fonctionnelles par siRNA que leur répression sur substrat rigide est dépendante de l’intégrité de la lamine.Dans une seconde étude, nous avons étudié la conservation de la réponse transcriptionnelle aux signaux mécaniques entre les BJ primaires et différentes souches de MSC. Nous avons découvert que la réponse à la rigidité de l’ECM implique des groupes de gènes communs et que ceux induits sur substrat rigide sont associés à diverses voies de signalisation impliquées dans le métabolisme. Nous avons également réalisé des recherches de motifs de facteurs de transcription et avons identifiés FOXO1 comme enrichis aux promoteurs des gènes induits sur substrat souple. Ainsi, dans le but de caractériser le rôle de FOXO1 dans l’établissement de la réponse transcriptionnelle au substrat souple, nous avons réalisé des études fonctionnelles au sein des BJ primaires à l’aide de siRNA.Dans une dernière étude, nous avons étudié la nécessité du domaine carboxy-terminal (CTD) de la sous-unité catalytique Rpb1 de la polymérase II dans la régulation du cycle de transcription en exprimant un mutant tronqué du CTD ne comprenant que 5 répétitions sur les 52 originales. Nous avons ainsi identifié que le CTD est dispensable pour le mécanisme de transcription à proprement parlé. Toutefois, les cellules mutantes arborent des défauts majeurs de terminaison de la transcription suggérant que le CTD est requis pour la terminaison de la transcription.

Cells sense and respond to their environment through the reception of soluble and mechanical cues. Tissue-level elasticity responsiveness is important for the priming of mesenchymal stem cells (MSC) toward a specific differentiation program and promotes invasiveness behaviour of cancer cells as well as activation of cancer-associated fibroblasts. Mechanotransduction is the mechanism by which cells will sense the mechanical signal at the plasma membrane and transduce it to the nucleus through the cytoskeleton and the LINC complex. At the cellular level, this cascade induces modifications of lamin A/C expression and participates to the activation of signaling pathways such as YAP/TAZ and SRF/MRTF. However, how and to what extent such changes influence chromatin organisation, chromatin landscape and gene expression remain largely elusive. To address these questions, we used hydrogels mimicking physiological stiffness found within tissues: one at 0.5kPa and one at 50kPa.In a first study, we characterized how mechanical cues influence 3D genome organisation, chromatin accessibility, histone marks associated with active and repressive regions as well as gene expression programs using various genomic techniques: Hi-C, ChIP-seq, Cut&Run, RNA-seq and ATAC-seq in primary fibroblasts (BJ). We identified approximately 5000 genes differentially expressed between our two culture conditions and produced an atlas of putative enhancers. The genome is organized into topologically associating domains (TADs) within which promoter-enhancer interactions are favored. TADs are in turn found in compartments A and B depending on their activities: compartment A contains mainly the active TADs and compartment B the inactive TADs. Although TADs do not seem to be impacted in a major way, we observed regions that are switching between compartments in response to ECM stiffness. Nuclear lamina is involved in genome organisation through lamina associating domains (LADs). While ECM stiffness remodels the lamina organisation, lamin B1 associated chromatin domains remain largely unchanged. We also identified a group of genes appearing as bivalent in both culture conditions, but specifically expressed in soft condition, and discovered through functional studies using siRNA that their repression in stiff condition is dependent on the integrity of the lamina.In a second study, we investigated the conservation of transcriptional responses to mechanical cues between primary BJ cells and MSCs. We found that the response to ECM stiffness involves common gene clusters and those induced on stiff substrate are associated with various signaling pathways involved in metabolism. We also performed transcription factor motif searches and identified FOXO1 as enriched in promoters of genes induced in soft condition. Thus, in order to characterize the role of FOXO1 in the establishment of transcriptional responses to the soft substrate, we performed functional studies in primary BJ cells using siRNA.In a last study, we investigated the requirement of the carboxy-terminal domain (CTD) of the catalytic subunit Rpb1 of the RNA Polymerase II in the regulation of the transcription cycle by expressing a truncated mutant of the CTD comprising only 5 repeats compare to 52 in normal case. We have identified that the CTD is dispensable for the mechanism of transcription. However, the mutant cells harbor major transcription termination defects suggesting that the CTD is required for transcription termination.