Régulations du renouvellement des petits ARN lors de l'élimination programmée de l'ADN chez Tetrahymena

Regulations of small RNA turnover during programmed DNA elimination in Tetrahymena

• Auteur / Autrice : Salman Shehzada
• Direction : Kazufumi Mochizuki
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 28/10/2022
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de génétique humaine (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Severine Chambeyron
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Kazufumi Mochizuki, Severine Chambeyron, Julius Brennecke, Mireille Betemier, Clément Carré
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Julius Brennecke, Mireille Betemier

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules eucaryotes

Petits ARN

Sumoylation

Mots clés libres

Regulations of Argonaute protein

SUMOylation

Programmed DNA elimination

Small non-Conding RNA

RNA Turnover

Dégradation ciblée des petits ARN

Regulations of Argonaute protein

SUMOylation

Programmed DNA elimination

Small non-Coding RNA

RNA Turnover

Target-Directed small RNA degradation

Résumé

Les petits ARNs d’environ 20-30 nucléotides régulent divers processus biologiques chez la plupart des eucaryotes. L’un des rôles conservés des petits ARNs est d’identifier les éléments génétiques envahisseurs autonomes et d’induire leur mutisme transcriptionnel par la formation d’hétérochromatine. Le protozoaire cilié Tetrahymena utilise ce mécanisme pour identifier les séquences dérivées de la transposition dans le génome du micronoyau germinal (MIC) et les élimine du génome macronucléaire somatique (MAC) pendant la reproduction sexuée. Au cours de ce processus d’élimination de l’ADN, environ 12 000 séquences internes éliminées (IESs), souvent dérivées des transposons, sont ôtées du nouveau MAC. Il a été démontré que les IESs sont ciblées par des petits ARNs appelés scnRNAs (~29-nt) pour induire la formation d’hétérochromatine suivie par l’élimination de l’ADN. Cependant, les scnRNAs sont produits à partir des IESs et des séquences destinées au MAC (MDS) du génome de la lignée germinale au début de reproduction sexuée. Puis, le processus de dégradation dirigée par les petits ARNs (TDSD) élimine les scnRNAs complémentaires aux MDS dans le MAC parentale en amont de l’élimination de l’ADN. Malgré que le TDSD soit le processus clé pour cibler spécifiquement les IESs pour l’élimination de l’ADN, son mécanisme moléculaire demeure obscur. Le but de mon projet doctoral est de mieux comprendre comment le processus TDSD est régulé dans Tetrahymena. Durant mon étude, j’ai identifié un nouveau gène, EMA2, qui est exclusivement exprimé pendant la reproduction sexuée et nécessaire pour compléter l’élimination de l’ADN. L’analyse par Northern blot et séquençage de petits ARNs a révélé que le TDSD est gravement affectée par l’absence d’EMA2. La protéine Ema2 possède un domaine SP-RING, partagé par une famille de ligases E3 SUMO, qui interagit directement avec l’enzyme Ubc9 E2 SUMO et qui est nécessaire pour l’accumulation de protéines SUMOylées pendant la reproduction sexuée; confirmant qu’Ema2 est un ligase E3 SUMO. J’ai également constaté qu’Ema2 est nécessaire pour la SUMOylation du régulateur transcriptionnel conservé Spt6 et pour la transcription globale du génome du MAC parentale en ARN non codant que nous avions précédemment proposé comme prérequis pour le TDSD. Au total, je propose que la SUMOylation de Spt6p dépendante d’Ema2p soit nécessaire pour la transcription du génome somatique en ARN non codant et donc pour le TDSD.

Small, about 20-30 nucleotides RNAs regulate various biological processes in most eukaryotes. One of the conserved roles of small RNAs is to identify invaded selfish genetic elements and induce transcriptional silencing through heterochromatin formation. The ciliated protozoan Tetrahymena use such mechanism to identify transposon-derived sequences in the germline micronuclear (MIC) genome and remove them from the somatic macronuclear (MAC) genome during the sexual reproduction. During this DNA elimination process ~12,000 internal eliminated sequences (IESs), many of which are related to transposons, are removed from the new MAC. It has been revealed that IESs are targeted for heterochromatin formation followed by DNA elimination by ~29-nt small RNAs, called scnRNAs. Although scnRNAs are produced from both IESs and MAC-destined sequences (MDSs) of the germline genome at the early sexual reproduction stages, target-directed small RNA degradation (TDSD) process degrades scnRNAs complementary to MDSs in the parental MAC prior to DNA elimination. While TDSD is the key process to specifically target IESs for DNA elimination, the molecular mechanism for TDSD remains poorly understood. The aim of my PhD project is to better understand that how the TDSD process is regulated in Tetrahymena. In my PhD study, I identified a novel gene, EMA2, which is exclusively expressed during sexual reproduction and required for completing DNA elimination. Northern blot and small RNA sequencing analysis revealed that TDSD is severely affected in the absence of EMA2. Ema2 protein possesses a SP-RING domain, which is shared among some SUMO E3 ligases, directly interacts with the SUMO E2 enzyme Ubc9 and is required for the accumulation of SUMOylated proteins during sexual reproduction, all indicating that Ema2 is a SUMO E3 ligase. I further found that Ema2 is necessary for the SUMOylation of the conserved transcriptional regulator Spt6 and for the genome-wide non-coding RNA transcription from the parental MAC that we previously proposed to be a prerequisite for TDSD. Altogether, I propose that Ema2p-dependent SUMOylation of Spt6p is necessary for the non-coding RNA transcription from the somatic genome and thus for TDSD.