Un mécanisme moléculaire pour le modèlequantitatif du cycle cellulaire : laphosphorylation par les CDK des régionsintrinsèquement non structurées.

A molecular mechanism for the quantitativemodel of the cell cycle : CDK-mediatedphosphorylation of intrinsically disordered regions

• Auteur / Autrice : Geronimo Dubra
• Direction : Daniel Fisher
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 23/09/2022
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier
• Jury : Président / Présidente : Ariane Abrieu
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Daniel Fisher, Ariane Abrieu, David Santamaria, Helfrid Hochegger
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : David Santamaria, Helfrid Hochegger

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cycle cellulaire

Kinases dépendantes des cyclines

Mots clés libres

Cycline

Cdk

Régions non structurée

Kinase

Cyclin

Cdk

Disordered regions

Kinase

Résumé

La progression du cycle cellulaire eucaryote est contrôlée par la famille des kinases dépendantes des cyclines (CDK). Ces enzymes, en complexe avec les cyclines, phosphorylent des substrats pour progresser dans les différentes phases du cycle cellulaire. À l'opposé de ce modèle qualitatif, le "modèle quantitatif" propose que la plupart des fonctions des CDK-cyclines sont redondantes et que ce sont les niveaux d'activité globale des CDK qui pilotent le cycle cellulaire. Les systèmes génétiques qui permettent aux scientifiques de manipuler les niveaux individuels de CDK sont essentiels pour répondre aux questions critiques qui aident à élucider quel modèle explique le mieux l'ensemble des preuves actuelles. Je présente ici mes avancées dans la conception de tels systèmes à introduire dans des cellules ayant des contextes génétiques différents.L'un des principaux dilemmes à résoudre en considérant le modèle quantitatif est de savoir comment une activité globale peut contrôler précisément le cycle cellulaire. Je suggère ici un mécanisme d'action par lequel la phosphorylation de régions intrinsèquement désordonnées des protéines contrôle la formation et la dissolution de condensats protéiques agissant comme des plaques tournantes biochimiques dans la cellule. CDK et des autres kinases du cycle cellulaire partagent la tendance à phosphoryler les régions désordonnées et leurs substrats contiennent plus de ces régions que le reste des protéines phosphorylées. De plus, une proportion frappante de protéines dans les condensats protéiques sont des cibles des CDK.Nous avons obtenu une carte de phosphorylation à haute résolution à travers la première division cellulaire d'embryons uniques de Xenopus laevis et avons confirmé qu'avant la mitose, une augmentation rapide de la phosphorylation globale se produit, la plupart étant médiée par la CDK. Nous avons détecté un nombre élevé de phosphorylations en interphase qui étaient enrichies en motifs de phosphorylation CDK et autres kinases du cycle cellulaire.Nous avons choisi le marqueur de prolifération Ki-67 comme étude de cas pour examiner comment la phosphorylation peut réguler le processus de séparation des phases, responsable de la formation des condensats moléculaires. Ki67 semble présenter des modes concurrents de régulation de la séparation de phase par la phosphorylation de son domaine répété, qui dépendent du contexte cellulaire et moléculaire. Il semble que différents niveaux de phosphorylation localiseront de manière différentielle le Ki-67 à l'hétérochromatine périnucléolaire pendant l'interphase et à la couche périchromosomique en mitose, toutes deux décrites comme étant en phase séparée.La théorie de l'action globale de la phosphorylation de la CDK dans le contrôle de la formation des centres biochimiques où se produisent les réactions spécifiques du cycle cellulaire manque cependant d'une explication détaillée des effets en aval de cette régulation. En prenant Ki-67 comme effecteur de la régulation de la séparation des phases médiée par les CDK, nous avons étudié les modifications de l'organisation de la chromatine dans les cellules dépourvues de Ki-67. Nous avons constaté que le knock-out de Ki-67 produit des changements massifs dans le transcriptome, partiellement dus à des changements dans les marques d'histones de la chromatine. Un autre mécanisme d'action de la phosphorylation des régions désordonnées des protéines médiée par les CDK pourrait être la régulation de l'activité des condensats auxquels ils participent activement. Les membres de la sous-famille CDK8/19 en complexe avec la cycline C constituent le domaine kinase du complexe Mediator, qui phosphoryle le domaine C-terminal désordonné de Pol II. La délétion à la fois de CDK8 et de CDK19 produit des altérations transcriptionnelles dans de multiples gènes, bien que ces changements soient plutôt de faible amplitude et que les changements transcriptionnels observés semblent dépendre du contexte cellulaire.

Eukaryotic cell cycle progression is controlled by Cyclin-Dependent Kinase family (CDK). Theseenzymes in complex with their mandatory binding partners, the cyclins, phosphorylate substrates to progress through the different phases of the cell cycle. Opposed to the qualitative model, an alternative model proposes that most CDK-cyclin function is redundant and it is the global CDK activity levels that drive the cell cycle. This so-called “quantitative model”, implies that there exist low and high overall CDK activity thresholds for entry into S-phase and mitosis, respectively, determined by the CDK regulatory network. Genetic systems that allow scientists to manipulate individual CDK levels are pivotal to addressing critical questions that help to elucidate which model explains better the current body of evidence.Here I present my advances in the design of such systems to be introduced into cells with different genetic contexts and into model organisms, as well. One of the main dilemmas to be solved when considering the quantitative model is how a global activity can precisely control all the biochemical states of the cell during the cell cycle. Here, I suggest a mechanism of action by which phosphorylation of intrinsically disordered regions of proteins control the formation and dissolution of protein condensates acting as biochemical hubs in the cell. Not only CDKs but most cell cycle kinases share the tendency of phosphorylating disordered regions and their substrates contain more of these regions that the rest of the phosphorylated proteins. Moreover, a striking proportion of proteins in the protein condensates are CDK targets.We obtained a high- resolution phosphorylation map through the first cell division of single embryos of Xenopus laevis and confirmed that before mitosis, a rapid increase of global phosphorylation occurs, most being CDK-mediated. We detected a high number of interphase phosphorylations that were enriched in CDK phosphorylation motifs and other cell cycle kinases.We selected the proliferation marker Ki-67 as a case study to investigate how phosphorylation can regulate the process of phase separation, responsible for the formation of the molecular condensates. Ki67 appears to present competing modes of regulation of phase separation by phosphorylation of its repeat domain, which will depend on the cellular and molecular context. It appears that different levels of phosphorylation will differentially localize Ki-67 to the perinucleolar heterochromatin during interphase and to the perichromosomal layer in mitosis, both described as being phase-separated.The theory of global action of the CDK phosphorylation in controlling the formation of biochemical centers where cell cycle-specific reaction happens lacks, however, a detailed explanation of the downstream effects of this regulation. Taking Ki-67 as an effector of CDK-mediated regulation of phase separation, we investigated what are the changes in chromatin organization in cells lacking Ki-67. We found that knockout of Ki-67 produces massive changes in the transcriptome, partially due to changes in chromatin histone marks, especially the inhibitory H3K27 trimethylation. Another mechanism of action of CDK-mediated phosphorylation of disordered regions of proteins might be the regulation of the activity of condensates in which they participate actively. Members of the CDK8/19 subfamily in complex with cyclin C constitute the kinase domain of the Mediator complex, which phosphorylates the disordered C-terminal domain of Pol II. Several other subunits of the Mediator are also reported to be disordered and this complex appears to undergo phase separation and form the so-called “super-enhancers”. The deletion of both CDK8 and CDK19 produces transcriptional alterations in multiple genes, although those changes are rather low in magnitude and the transcriptional changes observed seem to be dependent on the cellular context.