Étude du rôle des protéines Ribonucléases H dans la réponse cellulaire au stress réplicatif

Study of the role of Ribonucleases H proteins in the cellular response to replication stress

• Auteur / Autrice : Samira Kemiha
• Direction : Armelle Lengronne, Jérôme Poli
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 14/04/2022
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de génétique humaine (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Domenico Maiorano
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Sarah Lambert, Vincent Vanoosthuyse

Mots clés

Mots clés contrôlés

Ribonucléases

ARN -- Réplication

ADN -- Réplication

Mots clés libres

Réplication

Stress réplicatif

Résection

Transcription

Hybrides ARN:ADN

RNases H

DNA replication

Replication stress

Resection

Transcription

RNA:DNA hybrids

RNases H

Résumé

Au cours de la phase S, la réplication de l’ADN est initiée au niveau de multiples origines réparties le long du génome. La machinerie de réplication, ou réplisome, peut rencontrer des obstacles ralentissant sa progression, comme des structures secondaires de l’ADN ou des protéines liées à l’ADN telles que les ARN polymérases, générant ainsi ce que l’on appelle un stress réplicatif. Les réplisomes bloqués par un obstacle sont des structures fragiles qui peuvent générer des cassures et conduire à l’instabilité du génome. Lorsque la progression de l’ARN polymérase est ralentie ou arrêtée, le brin d’ARN naissant peut potentiellement s’hybrider avec le brin d’ADN complémentaire en déplaçant le second brin d’ADN, formant ainsi une structure à trois brins appelée R-loop, pouvant entraver la progression du réplisome. La coordination des processus de réplication et de transcription limite les interférences entre la réplication et la transcription. Cependant, cette coordination n’est pas parfaite et même dans des conditions physiologiques, la transcription et l’accumulation de R-loops peuvent conduire à des évènements de recombinaison, notamment au cours de la phase S. Les Ribonucléases H (RNases H) de type 1 et 2 sont des protéines impliquées dans la résolution des R-loops par la dégradation spécifique du brin d’ARN au sein du duplexe ARN:ADN. Les cellules dépourvues de RNases H présentent une accumulation de R-loops et sont extrêmement sensibles à différents agents génotoxiques induisant du stress réplicatif (e.g. MMS : méthanesulfonate de méthyle ou HU : hydroxyurée). Le but de mes travaux de thèse est de déterminer le rôle des RNases H dans la réponse cellulaire au stress réplicatif. Dans deux modèles cellulaires, la levure S. cerevisiae et les cellules humaines, nous avons pu montrer que les cellules déplétées en RNases H présentent des défauts de prise en charge et de redémarrage des fourches de réplication arrêtées en condition de stress réplicatif induit. L'utilisation de mutants de séparation de fonction de RNase H2 suggère que l’élimination défectueuse des hybrides ARN:ADN est responsable de ces défauts. La mesure du taux d’hybrides ARN:ADN au cours du cycle cellulaire montre qu’il augmente en phase S en présence de stress réplicatif exogène dans des cellules sauvages et mutantes pour RNases H. De plus, nos résultats indiquent que l’inhibition de la transcription ou la surexpression de l’hélicase ARN:ADN Sénataxine restaure la prise en charge et le redémarrage des fourches de réplication arrêtées lors d’un stress induit par le MMS et en absence des RNases H. Ainsi, l’ensemble de nos résultats suggère une étroite coopération entre les Ribonucléases H et l’hélicase Sénataxine pour résoudre les interférences entre les ARN polymérases et/ou les hybrides ARN:ADN avec les machineries de réplication.

During S phase, DNA replication starts at multiple origins distributed throughout the genome. As the replication machinery (or replisome) progresses throughout the DNA, it often encounters obstacles such as DNA secondary structures or transcription complexes, thereby generating what is called replication stress. Stalled replisomes are fragile structures that can give rise to chromosome breaks and trigger genome instability. When RNA polymerases stall, the nascent RNA can potentially anneal with the template DNA strand, creating a three-strand structure called R-loop. Coordination between replication and transcription in S phase limits the risks of collisions between the replisome and RNA polymerases. Even though, physiological transcription level and R-loops accumulation lead to recombination events in S phase. Type 1 and 2 ribonucleases H (RNase H) are specific proteins involved R-loops’ resolution through the degradation of the RNA strand within the RNA:DNA duplex. In the absence of RNases H, cells accumulate R-loops and are extremely sensitive to different replication stress-inducing genotoxic agents (e.g. MMS: methyl methanesulfonate or HU: hydroxyurea).The goal of my PhD project was to assess the roles of RNases H in the cellular response to replication stress. Using two cellular models, the budding yeast S. cerevisiae and mammalian cells, we demonstrated that RNases H mutations induce HU- and MMS-stalled replication forks processing and restart defects. Analysis of separation-of-function RNase H2 mutants suggests that it is the RNA:DNA hybrids removal activity of RNase H2 that is important for the correct processing of stalled forks experiencing replication stress. Indeed, quantification of RNA:DNA hybrids during the cell cycle reveals a higher level of hybrids in S phase in the presence of exogenous replication stress in both wild-type and RNases H-depleted cells. Moreover, our results demonstrate that the inhibition of transcrip tion or the overexpression of the RNA:DNA helicase Senataxin restore stalled replication fork processing and restart upon MMS treatment when cells lack RNase H2 activities. Altogether, our data indicate that Ribonucleases H1 and 2 and Senataxin helicase cooperate to resolve RNA polymerases and/or RNA:DNA hybrids interferences with replication.