Rôle des multicopper oxydases dans l'homéostasie du fer chez Arabidopsis thaliana

Role of multicopper oxidases (MCO) in iron homeostasis in Arabidopsis thaliana

• Auteur / Autrice : Alexis Brun
• Direction : Stéphane Mari
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie du développement
• Date : Soutenance le 08/09/2022
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : GAIA (Montpellier ; École Doctorale ; 2015-...)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Sciences des Plantes de Montpellier / IPSIM
• Jury : Président / Présidente : Christian Dubos
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Stéphane Mari, Sébastien Thomine, Jacques Bourguignon, Laurence Marquès, Thierry Desnos
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sébastien Thomine, Jacques Bourguignon

Mots clés

Mots clés contrôlés

Homéostasie

Oxydoréduction

Fer

Mots clés libres

Ferroxydase

Fer

Redox

Transport

Ferroxidase

Iron

Redox

Transport

Résumé

Le fer est un micronutriment essentiel universel pour des réactions primordiales du métabolisme (respiration, photosynthèse, transfert d'électron etc...). Bien qu'abondant, il est peu bio-disponible en milieu aérobie et peut générer des ROS. Son acquisition et son transport nécessite le contrôle de son statut redox pour limiter sa toxicité. En plus de la réduction du fer pour le mobiliser, les modèles eucaryotes possèdent des ferroxydases associées à des transporteurs pour acheminer le fer sous forme de Fe(III), moins toxique. Chez les plantes supérieures, la réduction du fer a bénéficié d'une attention particulière dans un contexte de lutte contre la carence en fer en culture, mais l'étude de la ferroxydation est restée superficielle jusqu'à récemment. Des ferroxydases existent chez Arabidopsis mais leur rôle, s’il existe, dans l’homéostasie du fer n’est pas encore élucidée. Chez Arabidopsis, il existe plusieurs ferroxydases potentielles dont une petite sous-famille de Multicopper-oxydases (MCO1,2,3) qui présente une grande similarité avec la ferroxydase modèle FET3 de S.cerevisiae. Dans mes travaux, j’ai pu mettre en évidence que parmi elles, MCO3 a une activité ferroxydase et complémente le mutant fet3fet4 ; MCO1 et MCO3 sont apoplastiques. Pour analyser le rôle physiologique de ces gènes, j’ai généré un triple mutant mco1,2,3 par CRISPR/Cas9. Grâce à des approches d’imagerie du fer, j’ai pu montrer que les cellules de mésophylle du triple mutant accumulent plus de fer que le sauvage. Plus précisément, on observe plus de fer dans les chloroplastes et dans les vacuoles. Ces observations ont été confirmées par l’analyse de l’expression de gènes liés au transport intracellulaire du fer. Chez le triple mutant mco1,2,3, les gènes VTL2 et VTL5, codant pour des transporteurs vacuolaires d’influx de fer sont induits alors que le transporteur vacuolaire d’efflux, NRAMP4, est réprimé. Cette sur-accumulation de fer pourrait entrainer une certaine toxicité, également suggérée par une plus forte production d’espèces réactives de l’oxygène chez le triple mutant. Je propose que ces AtMCOs formeraient une barrière supplémentaire dans la gestion de l’excès de fer à la surface des cellules du mésophylle, influençant ainsi la répartition du fer au niveau cellulaire en limitant son entrée dans la cellule foliaire. Les AtMCOs viennent ainsi agrandir la cohorte restreinte de ferroxydases d’Arabidopsis connues (avec LPR1 et LAC12 (Muller et al 2015 ; Bernal et al 2021)) dont l’intégration dans l’homéostasie du fer d’Arabidopsis reste à clarifier.

Iron is a universal essential micronutrient for primordial metabolism (respiration, photosynthesis, electron transfer etc ...). Although abundant, it is not bio-available in aerobic environments and can generate ROS. Its acquisition and transport require the control of its redox status to limit its toxicity. In addition to iron reduction to mobilize it, eukaryotic models have ferroxydases associated with transporters to transport iron in the form of Fe(III), less toxic than Fe(II). In higher plants, iron reduction has received particular attention in the context of the fight against iron deficiency in culture soil for crops, but the study of ferroxydation has remained superficial until very recently. Ferroxydases exist in Arabidopsis but their role, if any, in iron homeostasis has not yet been elucidated. In Arabidopsis, there are several potential ferroxydases including a small subfamily of Multicopper-oxidases (MCO1,2,3) which has a great similarity with the ferroxydase model FET3 of S.cerevisiae yeast. In my work, I was able to highlight that among them, MCO3 has a ferroxydase activity and complements the fet3fet4 mutant; MCO1 and MCO3 are apoplastic proteins. To analyze the physiological role of these genes, I generated a triple mutant mco1,2,3 by CRISPR/Cas9. Using iron imaging approaches, I was able to show that the mesophyll cells of the triple mutant accumulate more iron than the wild. Specifically, more iron is observed in chloroplasts and in vacuoles. These observations were confirmed by analysis of the expression of genes related to intracellular iron transport. In the triple mutant mco1,2,3, the VTL2 and VTL5 genes, encoding vacuolar iron influx transporters, are induced while the vacuolar efflux transporter, NRAMP4, is repressed. This over-accumulation of iron could lead to some toxicity, also suggested by a higher production of reactive oxygen species in the triple mutant. I propose that these AtMCOs would form an additional barrier in the management of excess iron at mesophyll cells surface, thus influencing iron distribution at the cellular level by limiting its entry into leaf cells. AtMCOs thus enlarge the small cohort of Arabidopsis known ferroxydases (with LPR1 and LAC12 (Muller et al 2015; Bernal et al 2021)) whose integration into Arabidopsis iron homeostasis remains to be clarified.