Caractérisation et validation d'une signature moléculaire des lymphocytes T régulateurs humains et de leur microenvironnement : mise en place d'un test compagnon

Characterization and validation of a natural and induced human regulatory T lymphocytes molecular signature : companion test set up

• Auteur / Autrice : Clara Milhem
• Direction : Nadirah Delhem
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie - FST
• Date : Soutenance le 18/01/2022
• Etablissement(s) : Université de Lille (2022-....)
• Ecole(s) doctorale(s) : École graduée Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Thérapies Assistées par Lasers et Immunothérapies pour l’Oncologie (Lille)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : IMMUNO-PDT
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Filoména Conti, Nathalie Bonnefoy
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Julien Zuber, Alexandre Belot

Mots clés

Mots clés contrôlés

PCR quantitative

Expression génique

Lymphocytes T régulateurs

Mots clés libres

Kit qPCR

Lymphocytes T régulateurs

Signature moléculaire

RT-PCR kit

Regulatory T cells

Molecular signature

Résumé

Les lymphocytes T régulateurs (Treg) sont une sous-population de cellules immunitaires connues pour leur rôle prépondérant dans la modulation de la réponse immunitaire innée et adaptative. Ils ont un rôle majeur dans la physiologie de l’organisme, mais également dans la mise en place des pathologies comme les inflammations chroniques, les maladies auto-immunes et les cancers. L’intérêt de mieux caractériser et suivre l’évolution des Tregs n’est plus à démontrer, qui plus est à l’ère des immunothérapies. En ce sens, notre équipe a établi une signature moléculaire unique des Tregs, basée sur l’expression de 81 gènes permettant de les caractériser et d’évaluer leur modulation. Ainsi, la validation de la signature moléculaire aboutira à l’établissement d’un kit compagnon couplé à un algorithme de lecture. Cela permettra de prévenir de façon fiable et rapide les effets indésirables de nouvelles molécules, de la recherche jusqu'à la clinique, vis-à-vis du système immunitaire.La première partie des résultats de qPCR sur les Tregs isolés d’individus sains a permis de conclure à la stabilité d’expression pour 84% des gènes de la signature. Ce ratio monte jusqu’à 92% pour l’évaluation de la stabilité d’expression des gènes dans les PBMC des mêmes donneurs. Ces résultats, très prometteurs, nécessitent d’être confirmés sur une plus grande population. Ainsi, l’étude d’une corrélation mathématique entre les niveaux d’expressions géniques des Tregs isolés et des PBMC autologues a été entrepris. Cette étude a permis de montrer que l’expression de 11 gènes est corrélée de manière linéaire à plus de 70% entre Tregs isolés et PBMC autologues.Dans un second temps, ce travail a permis d’évaluer la réponse de la signature face à des agents modulateurs décrits pour activer ou inhiber les Tregs. Cette étape a validé la bonne réactivité de certains gènes face aux agents modulateurs. C’est le cas de 4 gènes, qui diminuent significativement quand l’activité suppressive des Tregs est inhibée par un anticorps monoclonal anti-galectine-9. Néanmoins, l’analyse de variance multivariée n’a pas permis de montrer que les variations d’expression observées sont exclusivement dues au traitement sur la base des 10 donneurs, il semble que la variabilité interindividuelle entre en jeu dans l’analyse de certains groupes de gènes.Enfin, le comportement de la signature a été évalué chez 4 patients, inclus dans un essai clinique pour le traitement de différents types de cancer par radiothérapie stéréotaxique hypo fractionnée à haute dose. Encore une fois, les résultats obtenus sont très prometteurs puisque l’évolution biologique et clinique des patients est corrélée avec l’évolution d’expression des gènes de la signature. Ces données constituent une première confirmation de l’utilité d’une telle signature dans l’immuno-monitoring des patients.Ces études sont très encourageantes pour le développement d’un algorithme de lecture automatisé des résultats. Ainsi, le kit pourra être positionnable sur le marché de la recherche fondamentale jusqu’en clinique, pour l’évaluation des Tregs et leurs microenvironnements dans tous types d’études.

Regulatory T cells (Treg) are an immune cell subpopulation known for their important role in innate and adaptive immune response contraction. They have a major role in physiology, but also in pathologies outcome such as chronic inflammations, autoimmune diseases and cancers. A better characterization and follow of Treg evolution are clearly needed, especially in the era of immunotherapies. Our team has established a unique Treg molecular signature based on the expression of 81 genes, allowing to characterize and to evaluate Treg modulation. Thus, the molecular signature validation will lead to the establishment of a companion kit coupled with a reading algorithm. This will allow to reliably and rapidly prevent the adverse effects of new molecules, from research to the clinic, regarding the immune system.The first part of the RT-PCR results on healthy donors isolated Tregs allowed to conclude that 84% of the genes have stable expression. This ratio rises to 92% for the stability evaluation of gene expression in PBMC from the same donors. These results are very promising, but need to be confirmed on a larger population. To go further the presence of a mathematical correlation between isolated Tregs and autologous PBMC gene expression levels, have been researched. This study showed that the expression of 11 gene are linearly correlated beyond 70%. Afterward, the signature response to modulating agents described to activate or inhibit Tregs have been asses. Here, the genes good response to modulating agents is proved: 4 gene expression decrease significantly when Tregs suppressive activity is inhibited by an anti-galectin-9 monoclonal antibody. Nevertheless, multivariate analysis of variance failed to show that the expression variations are exclusively due to treatment with 10 donors, it seems that interindividual variability has a role in some gene response to modulator. Finally, the signature behavior was evaluated in 4 patients, included in a clinical trial for cancer treatment by high dose hypo fractionated stereotactic radiotherapy. Once again, the results obtained are very promising since the biological and clinical patients’ evolution is correlated with the gene expression modulation. These data constitute a first confirmation of the usefulness of such a signature in the immuno-monitoring of patients.These outcomes are very encouraging for the development of an automated reading algorithm. Thus, the kit could be positioned on the market from basic research to the clinic, for the evaluation of Tregs and their micro environments in all types of studies.