Mécanisme de la lignification : isolement et caractérisation des enzymes, transformation des substrats in vitro, et caracterisation de la lignine obtenue

Mechanism of lignification : isolation and characterization of enzymes, in vitro transformation of substrates, and characterization of the obtained lignin

• Auteur / Autrice : Ranin Dabbousy
• Direction : Christian Rolando, Youssef Bakkour
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie organique, minérale, industrielle
• Date : Soutenance le 05/12/2022
• Etablissement(s) : Université de Lille (2022-....) en cotutelle avec Université Libanaise
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la matière, du rayonnement et de l'environnement (Lille ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Miniaturisation pour la synthèse, l'analyse et la protéomique (MSAP)
• Jury : Président / Présidente : Simon Hawkins
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Ziad Fajloun, Jihad Attieh, Zeina Hobaika
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Paul-Henri Ducrot, Bernard Kurek

Mots clés

Mots clés contrôlés

Spectrométrie de masse

Protéomique végétale

Oxydation

Phénols

Laccase

Peroxydases

Enzymes immobilisées

Synthèse (chimie)

Lignine

Mots clés libres

Lignification

Radicaux Phénoxy

Lignin

Peroxidase

Phenoxyl radicals

Résumé

La lignine est le deuxième biopolymère sur terre mais le mécanisme de sa formation et ses structures sont encore mal compris. Dans ce travail, la lignine et la lignification ont été étudiées selon trois stratégies. La première stratégie a été développée pour étudier les liaisons inter-unités de la lignine formées par l'action d'enzymes immobilisées qui permettent de mimer l'environnement hydrophobe de la synthèse de la lignine en utilisant un composé monomère modèle de la lignine. La deuxième stratégie s'est concentrée sur l'identification des peroxydases spécifiques de la lignine, grâce à l'isolement des peroxydases à partir des feuilles et des tiges de plantes modèles. La troisième stratégie a consisté en l'utilisation de monolignols porteurs de groupement alcynes. Cette stratégie a permis d'étudier le comportement des peroxydases lors de l'oxydation des monomères de lignine et d'aborder la lignification en étudiant l'inactivation ou l'identification des peroxydases de lignification via des réactions de chimie_clic.La première stratégie a consisté en l'immobilisation d'oxydoréductases modèles comme la peroxydase de raifort (HRP) et la laccase de Myceliophthora thermophila (MtL) sur des billes de résine hydtophobes Immobeads®150P. Un rendement d'immobilisation élevé (≥75 %) des deux enzymes a été atteint. Les enzymes immobilisées ont été utilisées pour l'étude de la polymérisation de la vanilline comme modèles de lignine. La réaction d'oxydation de la vanilline catalysée par la HRP immobilisée a entraîné la formation de polyvanilline avec jusqu'à 15 unités principalement liées par des liaisons carbone-oxygène comme montré par les analyses MALDI-FT-ICR après dérivatisation en milieu acide ou basique. Dans la deuxième stratégie les peroxydases d'eucalyptus et d'épinards ont été partiellement purifiées à l'aide d'une précipitation au sulfate d'ammonium dans un taux de saturation de 80% et d'une chromatographie par échange d'ions DEAE avec un facteur de purification de 3 pour les peroxydases d'eucalyptus et de 2 et 7 pour les peroxydases de la tige et des feuilles d'épinard, avec une récupération enzymatique de 6%, 5% et 13% respectivement. Les peroxydases purifiées ont été identifiées par protéomique grâce à la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (analyse nano LC-MS/MS). Dans la troisième stratégie, la modification de l'activité de la HRP lors de l'oxydation de ses substrats a été étudiée à l'aide de monolignols modifiés porteurs de fonctions alcynes. Lors de l'oxydation des phénols, la HRP génère des radicaux phénoxy en présence de H2O2. Ces radicaux modifient la HRP en réagissant avec l'hème ou l'apoprotéine suivant différentes voies. Parmi les sondes de lignification utilisées dans cette étude, les composés dérivés de l'acide coumarique inhibent efficacement la efficacement et spécifiquement. Des études cinétiques ont montré que deux sondes en particulier, le coumarate de propargyle et le coumarate de méthyle conduisent à une perte complète de l'activité de la HRP x. Les analyses de protéomique et de spectrométrie de masse ont permis de déchiffrer les raisons de cette inactivation en permettant d'identifier les modifications de l'hème et les altérations des acides aminés de la fraction protéique de la HRP.L'ensemble de ces résultats montre que les techniques avancées de spectrométrie de masse et de protéomique contribuent à une meilleure compréhension du devenir des radicaux phénoxy lors de la lignification.

Lignin is the second biopolymer on earth but the mechanism of its formation and its structures are still poorly understood. In this work, lignin and lignification were studied following three strategies. The first strategy was developed to study lignin interunit linkages formed using a simple lignin monomeric compound implying immobilized enzymes that allowed to mimic the hydrophobic environment for lignin synthesis. The second strategy focused on the identification of lignin-specific peroxidases, through the isolation of peroxidases from the leaves and stems of model plants. The third strategy, which consisted of the usage of alkyne-bearing monolignols allowed to study the behavior of peroxidases during the oxidation of lignin monomers. It also allowed to tackle lignification through studying the inactivation or the identification of lignification peroxidases via click-chemistry reactions.The first strategy consisted of the immobilization of model oxidoreductases including horseradish peroxidase (HRP) and laccase from Myceliophthora thermophila (MtL) on hydrophobic beads. High immobilization yield (≥75%) of both enzymes was achieved. The immobilized enzymes were used for the investigation of vanillin polymerization as a template of lignin. Oxidation reaction of vanillin catalyzed by immobilized HRP resulted in the formation of polyvanillin with up to 15 units, mainly linked by carbon-oxygen linkages as revealed by MALDI-FT-ICR analyses after derivatization in either acidic or basic medium. In the second strategy peroxidases from eucalyptus and spinach plants were partially purified using ammonium sulfate precipitation in a saturation ratio of 80% and DEAE-ion exchange chromatography with a purification fold of 3 for eucalyptus peroxidases and 2 and 7 for spinach stem and leaves peroxidases, with an enzyme recovery of 6%, 5% and 13% respectively. Purified peroxidases were identified by proteomics using liquid chromatography coupled to mass spectrometry (nano LC-MS/MS analysis). In the third strategy, the modification of the activity of HRP during the oxidation of its substrates was studied using modified monolignols bearing alkyne tags. During phenol oxidation, HRP generates phenoxyl radicals in the presence of H2O2. These radicals react with HRP affecting its heme or its apoprotein following different pathways. Among the ligninication probes used in this study, coumaric acid-derived compounds efficiently inhibited HRP with different efficiency and specificity. Particularly two probes, propargyl coumarate and methyl coumarate were responsible for a complete loss of HRP activity as revealed by a kinetic study. Proteomics and mass spectrometry analyses helped decipher the reasons behind this inactivation including modifications of heme and amino acid alterations of the HRP protein moiety.Altogether these results show that advanced mass spectrometry techniques and proteomics contribute to better understanding of the fate of phenoxyl radicals during lignification.