Étude de nouveaux facteurs de pathogénicité de Klebsiella pneumoniae : caractérisation du fimbriae de type « chaperone-usher » Kpg et de la pompe à efflux MdtJI

Study of new pathogenicity factors of Klebsiella pneumoniae : characterization of the Kpg chaperone-usher fimbriae and the Mdt efflux pump

• Auteur / Autrice : Laura Joseph
• Direction : Damien Balestrino
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 22/07/2022
• Etablissement(s) : Université Clermont Auvergne (2021-...)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences de la vie, santé, agronomie, environnement (Clermont-Ferrand)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire Microorganismes : Génome et environnement
• Jury : Président / Présidente : Régine Talon
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Guillaume Dalmasso
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sandra Da Re, Sylvie Nazaret, Jean-Philippe Lavigne

Mots clés

Mots clés contrôlés

Klebsiella pneumoniae

Mots clés libres

Klebsiella pneumoniae

Biofilm

Pompes à efflux

Fimbriae

Chaperone-usher

Facteurs de virulence et de pathogénicité

Klebsiella pneumoniae

Biofilm

Efflux pump

Fimbriae

Chaperone-usher

Virulence and pathogenicity factors

Résumé

Klebsiella pneumoniae est une entérobactérie à Gram-négatif ubiquiste que l’on retrouve dans l’environnement (sols, eaux de surface, …) ainsi que dans le système digestif humain. En milieu hospitalier, cette bactérie est un pathogène opportuniste à l’origine d’infections liées aux soins, notamment pulmonaires et urinaires. Grâce à sa capacité à former des biofilms, K. pneumoniae colonise facilement les épithéliums tels que ceux des voies aériennes supérieures et du tractus digestif, ainsi que des dispositifs médicaux invasifs. Les phénomènes de colonisation et de formation de biofilm sont des éléments clés de la pathogénicité de K. pneumoniae. Ils impliquent des structures de surface, et notamment la capsule polysaccharidique et les fimbriae de type I et de type III (Paczosa et al., 2020). De précédents travaux menés au laboratoire ont permis d’identifier d’autres facteurs de pathogénicité, certains étant spécifiquement impliqués dans la colonisation du tube digestif et des surfaces (Balestrino et al., 2005, 2008; Coudeyras et al., 2008; De Araujo et al., 2010; Hennequin and Forestier, 2007, 2009; Maroncle et al., 2002, 2006). De plus, dans le but d’identifier de nouvelles structures d’adhésion de K. pneumoniae, une analyse in silico a permis d’identifier une structure de surface de type « chaperone-usher » (CU), appelée Kpg, impliquée dans la colonisation intestinale dans un modèle murin (Khater et al., 2015). A partir d’un biofilm mature, les bactéries peuvent se disperser sous forme de bactéries isolées ou de petits agrégats. Cette étape de dispersion a longtemps été sous-estimée dans le processus de développement des infections bactériennes, mais des données récentes indiquent qu’elle jouerait un rôle crucial dans l’apparition d’infections aiguës ou chroniques difficiles à éradiquer. Alors que l’impact de la dispersion des biofilms dans la physiopathologie des infections à K. pneumoniae est méconnue, nous avons montré que les bactéries dispersées K. pneumoniae sont dans un état physiologique spécifique et qu’elles ont des propriétés de colonisation des surfaces accrues comparativement aux formes planctoniques (Guilhen et al., 2019). Une approche globale par séquençage d’ARN (RNAseq) a identifié de nombreux gènes de K. pneumoniae surexprimés dans les bactéries dispersées comparativement aux formes sessiles ou planctoniques, et notamment les gènes mdtJI codant la pompe à efflux MdtIJ de la famille des SMR (Guilhen et al., 2016, 2019).L’objectif de mon projet de thèse était de caractériser les fimbriae Kpg et la pompe à efflux MdtJI afin de décrire leur rôle dans la pathogénicité de K. pneumoniae. Une analyse in silico a montré que le système Kpg est retrouvé au sein de plusieurs espèces d’Entérobactéries, principalement au sein d’espèces du genre Klebsiella, et que son acquisition résulte probablement de transferts horizontaux de gènes. Bien que le système Kpg soit faiblement exprimé dans la souche K. pneumoniae CH1476 en conditions de laboratoire, sa localisation membranaire a été confirmée par Western blot. L’analyse phénotypique d’un mutant déficient ∆kpgABCD a montré que le système Kpg est impliqué dans la formation de biofilm en présence de sels biliaires, une condition retrouvée au sein du tractus digestif. En effet, alors que la formation de biofilm de la souche sauvage de K. pneumoniae est stimulée par la présence de sels biliaires, aucun effet des sels biliaires n'a été observé pour le mutant isogénique. Aucun rôle du fimbriae Kpg dans l’adhésion aux cellules intestinales n’a cependant été démontré.La seconde partie de ma thèse a consisté à analyser les propriétés de la pompe à efflux MdtJI. (...)

Klebsiella pneumoniae is a ubiquitous Gram-negative Enterobacteriaceae found in soils and surface waters as well as in the human tract. In hospitals, K. pneumoniae is known as an opportunistic pathogen causing healthcare-related infections, particularly pulmonary and urinary infections. Its ability to form biofilm allow an efficient colonization of invasive medical devices as well as host tissues such as the upper airways and the digestive epitheliums. The biotic and abiotic surface colonization is a major element for the pathogenicity of K. pneumoniae. It involves many bacterial surface structures, among them the polysaccharide capsule and type I and type III fimbriae are well described (Paczosa and Mecsas, 2016). Previous studies carried out in our laboratory has identified other bacterial factors involved in the pathogenicity of K. pneumoniae, including factors involved in the colonization of surfaces and digestive tract (Balestrino et al., 2005, 2008; De Araujo et al., 2010; Hennequin and Forestier, 2007, 2009; Maroncle et al., 2002, 2006). In order to identify new adhesive structures, an in silico analysis was performed on K. pneumoniae genome and identified a novel chaperone-usher (CU) fimbriae called Kpg. The analysis of the phenotype of a deletion mutant suggested that this fimbriae is involved in intestinal colonization in a murine model (Khater et al., 2015).From a mature biofilm, bacteria can disperse as isolated bacteria or as small aggregates. This dispersal process has long been underestimated in the development of biofilm secondary bacterial, but recent data indicate that it plays a crucial role in the development of acute or chronic infections. While the impact of biofilm dispersal in the pathophysiology of K. pneumoniae infections is poorly understood, we have shown that biofilm-dispersed bacteria are in a specific physiological state with enhanced surface colonization properties compared to planktonic forms (Guilhen et al., 2019). A global RNA sequencing approach (RNAseq) identified many K. pneumoniae genes overexpressed in dispersed bacteria compared to sessile or planktonic forms, most notably the mdtJI genes encoding the MdtIJ efflux pump of the SMR family (Guilhen et al., 2016, 2019). The objective of my thesis project was the characterization of the Kpg fimbriae and the Mdt efflux system in order to decipher their role in the pathogenicity of K. pneumoniae. An in silico approach revealed that the Kpg system is mainly found in species belonging to the Klebsiella genus, and suggested that its acquisition results from horizontal transfers. Although Kpg fimbriae was weakly expressed in the K. pneumoniae CH1476 strain under routine laboratory conditions, the presence of this structure on the bacterial membrane was confirmed by Western blot. Given the potential role of this system at the intestinal level, the properties of a kpgABCD isogenic mutant to adhere to intestinal cells in vitro and to form biofilm in presence of bile salts (which is a physiological condition encountered in the gastrointestinal tract) were evaluated. Whereas Kpg was not involved to adhere to intestinal cells, a potential role to form biofilm in presence of bile salts was shown. Indeed, while biofilm formation by the wild-type strain is stimulated by bile salts, no effect of bile salts was observed for the isogenic mutant. The second part of my thesis consisted in analyzing the properties of the MdtJI efflux pump. For this purpose, an isogenic ∆mdtIJ mutant was constructed. Since efflux pumps are involved in many bacterial processes, phenotypes of an isogenic ∆mdtIJ mutant were analyzed and compared to those of the wild-type strain: ability to form a biofilm, biofilm strength, ability to adhere to lung cells, resistance to lysis in macrophages and growth in the presence of different substrates. (...)