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Thèse Année : 2022

Double-strand break repair during meiosis in Arabidopsis thaliana

Réparation des doubles cassures de l'ADN pendant la division méiotique chez Arabidopsis thaliana

Résumé

Meiosis, a specialized cell division of the germ cells, is the chromosomal foundation of sexual reproduction in eukaryote organisms. At the outset of meiosis, a programmed induction of double-strand breaks (DSBs) initiates an intricate and highly regulated process for their repair via homologous recombination (HR), leading to the formation of crossovers - reciprocal exchanges of extensive chromosomal segments. The first steps of DSB repair involves the processing of the DSBs and the formation of recombinase-DNA nucleofilaments which, with the help of multiple cofactors, catalyse the search for and invasion of an homologous template. In Arabidopsis thaliana somatic tissues, RAD51 is the recombinase in charge. During meiosis, however, RAD51 plays a supporting role of a meiotic-specific recombinase, DMC1, which catalyses these first steps of HR. In accordance with this, some of the RAD51 instrumental cofactors in somatic repair, such as RAD54 and the RAD51 paralogues RAD51B, RAD51D and XRCC2, are dispensable during meiosis. Given that in absence of DMC1, RAD51 is able to catalyse homology search and strand exchange, proficiently repairing meiotic DSBs, we wondered whether these cofactors become necessary under the hypothesis that their lack of role in wild-type meiosis would be a consequence of the non-catalytic role of RAD51. Indeed, this was the case for RAD54, which we show becomes for meiotic DSB repair and RAD51 nucleofilament function in absence of DMC1. Surprisingly, this is not so for RAD51B, RAD51D and XRCC2, which remained dispensable in the absence of DMC1, hinting at different needs for RAD51-mediated DSB repair in somatic and meiotic cells and leaving the door open for further exploration. In Arabidopsis thaliana, DSBs largely outnumber crossovers ( 20:1). This excess of breaks is repaired using different HR pathways. However, the molecular detection of the non-crossover repair products has been proven challenging, presumably due to the short length of their gene conversion tracts and their sparse localization along the genome. Some of the mechanistic features of both crossover and non-crossover products described in other model organisms, as well as factors that modulate their localization and regulation, remain poorly understood in the model plant. To overcome current technical limitations, we propose the introduction of targeted DSBs at early meiosis using CRISPR/Cas9 systems. By doing so, we would generate an initiation point for HR events at desired locations that would facilitate the detection and mechanistic analysis of repair products. The introduction of DSBs in varied genetic and epigenetic contexts and in multiple genetic backgrounds would permit the direct comparison between controlled conditions to study how they affect DSB repair during meiosis. We designed multiple CRISPR/Cas9 constructs that were able to cleave their target sites at moderate efficiencies and, for some of them, to induce increases of the recombination rate of intervals spanning these sites in individual plants, with high overall variability. We, however, could not detect CRISPR/Cas9-induced DSB repair outcomes at single- molecule level via next-generation sequencing of meiotic products. The use of nucleotide analogues have permitted for decades the cytological and molecular detection of DNA synthesis events, notably DNA replication, in multiple organisms. Given that DNA synthesis is inherent to all meiotic recombination pathways, we wondered if we could profit from one of these analogues (EdU) to label meiotic DSB repair events happening during meiosis in Arabidopsis thaliana. To do so, we designed and validated a protocol that permitted the cytological identification and characterisation of SPO11-dependent meiotic DSB repair-associated DNA synthesis tracts, which offers a new standard tool for the study of meiotic recombination in Arabidopsis. (...)
La méiose est une division cellulaire spécialisée des cellules germinales qui est essentielle pour la reproduction sexuée des organismes eucaryotes. Au début de la méiose, l’induction programmée de cassures double-brin (CDB) initie un processus complexe et hautement régulé pour leur réparation par recombinaison homologue (RH) conduisant à la formation de crossovers - échanges réciproques de larges segments chromosomiques. Les premières étapes de la réparation des CDB impliquent le traitement des CDB et la formation de nucléofilaments ADN-recombinase qui, avec l'aide de multiples cofacteurs, catalysent la recherche et l'invasion d’une séquence d’ADN homologue . Dans les tissus somatiques d'Arabidopsis thaliana, RAD51 est la recombinase réalisant cette fonction. Pendant la méiose, cependant, RAD51 joue un rôle de soutien d'une recombinase spécifique à la méiose, DMC1, qui catalyse ces premières étapes de la RH. Conformément à cela, certains des cofacteurs de RAD51 dans la réparation somatique, comme RAD54 et les paralogues de RAD51, RAD51B, RAD51D et XRCC2, ne sont pas nécessaires pendant la méiose. Étant donné qu'en l'absence de DMC1, RAD51 est capable de catalyser la recherche d'homologie et l'échange de brins, réparant ainsi efficacement les CDB méiotiques, nous nous sommes demandés si ces cofacteurs deviennent nécessaires, dans l'hypothèse où leur absence de rôle dans la méiose de type sauvage serait une conséquence du rôle non catalytique de RAD51. En effet, c'était le cas pour RAD54, dont nous montrons qu'il devient indispensable pour la réparation des CDB méiotiques et la formation du nucléofilament de RAD51 en absence de DMC1. De manière surprenante, ce n'est pas le cas pour RAD51B, RAD51D et XRCC2, qui restent dispensables en l'absence de DMC1, ce qui laisse supposer que la réparation des CDB médiée par RAD51 a des besoins différents dans les cellules somatiques et méiotiques et laisse la porte ouverte à de nouvelles explorations. Chez Arabidopsis thaliana, les CDB sont largement plus nombreuses que les crossovers ( 20:1). Ces cassures surnuméraires sont réparées par différentes voies de HR. Cependant, la détection moléculaire des produits de réparation non-crossovers s'est avérée difficile, probablement en raison de la courte longueur de leurs segments de conversion génétique et de leur localisation éparse le long du génome. Certaines des caractéristiques mécaniques des produits de réparation crossovers et non-crossovers décrites chez d'autres organismes modèles, ainsi que les facteurs qui modulent leur localisation et leur régulation, restent mal comprises chez la plante modèle. Pour surmonter les limitations techniques actuelles, nous proposons l'introduction de CDBs ciblées au début de la méiose en utilisant les systèmes CRISPR/Cas9. Ce faisant, nous générerions un point d'initiation pour les événements HR aux endroits souhaités, ce qui faciliterait la détection et l'analyse mécanistique des produits de réparation. L'introduction de CDBs dans des contextes génétiques et épigénétiques variés et dans des régions génétiques multiples permettrait de comparer directement entre des conditions contrôlées pour étudier comment elles affectent la réparation des CDBs pendant la méiose. Nous avons conçu de multiples constructions CRISPR/Cas9 qui ont été capables de cliver leurs sites cibles à des efficacités modérées et, pour certaines d'entre elles, d'induire des augmentations du taux de recombinaison des intervalles qui englobent ces sites dans des plantes individuelles, avec une grande variabilité globale. Cependant, nous n'avons pas pu détecter les produits de la réparation des CDBs induites par CRISPR/Cas9 au niveau de la molécule unique via le séquençage de nouvelle génération des produits méiotiques. L'utilisation d'analogues nucléotidiques permet depuis des décennies la détection cytologique et moléculaire des événements de synthèse de l'ADN, notamment la réplication de l'ADN, dans de multiples organismes. (...)
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2022UCFAC023_HERNANDEZ_SANCHEZ_REBATO.pdf (93.55 Mo) Télécharger le fichier
Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-03943077 , version 1 (17-01-2023)

Identifiants

  • HAL Id : tel-03943077 , version 1

Citer

Miguel Hernandez Sanchez-Rebato. Double-strand break repair during meiosis in Arabidopsis thaliana. Plants genetics. Université Clermont Auvergne, 2022. English. ⟨NNT : 2022UCFAC023⟩. ⟨tel-03943077⟩
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