Ever smarter molecular tools for studying alternative nucleic acid strutcures in human cell

Des outils moléculaires toujours plus multifonctionnels pour l’étude de structures alternatives d’acides nucléiques.

• Auteur / Autrice : Francesco Rota Sperti
• Direction : David Monchaud, Ibai Valvarde
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 20/10/2022
• Etablissement(s) : Bourgogne Franche-Comté
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Carnot-Pasteur (Besançon ; Dijon ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : Etablissement de préparation : Université de Bourgogne (1970-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Chimie Moléculaire de l'Université de Bourgogne (ICMUB) (Dijon)
• Jury : Président / Présidente : Franck Denat
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Frédéric Boschetti
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Filippo Doria, Daniela Verga

Mots clés

Mots clés contrôlés

G-quadruplexes

Acides nucléiques

ARN messagers

ADN

Mots clés libres

Structures alternatives

Acides nucléiques

Outils moléculaires

Nucleic acid

Alternative strutcures

Molecular tools

Résumé

Les quadruplexes d’ADN et d’ARN, ou G-quadruplexes (ou G4s), sont des structures secondaires d’acides nucléiques qui se forment au sein de séquences riches en guanines (Gs) de notre génome et transcriptome. Les rôles biologiques des G4s sont actuellement au cœur d’un engouement scientifique intense, mais ils ne sont pas encore compris avec exactitude. Pour gagner des informations précieuses quant à ces rôles, l’utilisation des petites molécules (ou ligands) est cruciale car elle permet d’étudier la biologie des G4s en milieu cellulaire. Notre recherche s’inscrit dans cette dynamique et tend à développer une classe d’outils originaux appelés TASQ (pour template-assembled synthetic G-quartets). Les TASQs sont composés de quatre Gs assemblées autour d’un gabarit (template) central, qui peuvent donc former un G-quartet intramoléculaire. Ce faisant, les TASQs interagissent avec les G4s selon un processus bioinspiré, reposant sur la forte interaction entre deux G-quartets, l’un synthétique (TASQ) et l’autre natif (G4). Dans le cadre de ce travail de thèse, nous avons développé une série de nouveaux TASQs, répondant à des besoins chémobiologiques précis.Nous avons tout d’abord amélioré la synthèse du BioTASQ, une des molécules phare de notre laboratoire, utilisée comme hameçon moléculaire pour l’isolation et l’identification des G4s in vitro et in vivo. Nous avons ensuite développé des dérivés plus facile d’accès et plus performants, les BioCyTASQ et BioTriazoTASQ. Grâce à ses propriétés de reconnaissance de G4s optimisées, le BioCyTASQ est devenu la molécule de choix pour nos études. Le BioTriazoTASQ, assemblé par chimie click a, quant à lui, montré une affinité particulière pour les G4s d’ARN, qui méritera d’être exploitée plus avant. Nous avons ensuite développé des outils plus versatiles, disposant d’une fonction supplémentaire permettant des manipulations bioorthogonales en cellules.Les MultiTASQ et azMultiTASQ sont en effet équipés de chaine alcyne et azide leur permettant d’être fonctionnalisés par chimie click (avec ou sans catalyseur, i.e., CuAAC ou SPAAC) in situ. Cela peut être exploité pour la visualisation de G4s en cellules humaines (in situ click imaging) et leur isolation/identification (click-seq). Un composé encore plus versatile, le photoMultiTASQ, a été synthétisé dans le but de conduire de concert des études génomiques et protéomiques.Nous avons ensuite retravaillé la synthèse d’une sonde fluorescente TASQ nommée N-TASQ, et développé un nouvel analogue, le tzN-TASQ. Cette molécule est plus facilement accessible car son assemblage repose sur la chimie click. A nouveau, ce TASQ assemblé par chimie click a montré une affinité particulière pour les G4s d’ARN, qui méritera également d’être exploitée plus avant. Nous avons aussi conçu puis synthétisé une nouvelle sonde, le Square-TASQ, dont les propriétés photophysiques font d’elles une sonde NIR (near infrared) prometteuse. Nous avons donc, au cours de cette thèse, étendu le portefeuille d’outils TASQs qui permettent de voir, d’isoler et d’identifier les G4s dans un contexte cellulaire, dans le but final de gagner des informations précieuses quant à leur biologie.

G-Quadruplexes (G4) are non-canonical secondary structure found throughout the genome and transcriptome in guanine rich sequences. Their involvement in biologically relevant processes (telomeres maintenance, transcription and translation) has been demonstrated, yet their role is still not fully elucidated. To investigate their role, we focus on the development of biomimetic molecular tools that could be used either to isolate G4 by new generation sequencing techniques or visualize them directly in cell. This class of molecular tools (TASQ: Template Assembled Synthetic Quartet) is composed by four guanine moieties linked to a central template thanks to spacers of different chemical nature. In presence of the target the four Gs assemble in a synthetic tetrad that, by stacking on top of the native G4, stabilize its structure. The unique nature of the interaction (like-likes-like) ensure an exquisite level of selectivity. Moreover, the central template can be easily functionalized (i.e., by addiction of an appendix) or exhibit interesting properties (i.e., fluorescence) introducing a very desirable level of versatility. Starting from these premises our goal was to improve the chemical accebility and the molecular tools portfolio, developing new TASQ designs. We first focused on the development of TASQ bearing a biotin appendix specifically designed for sequencing purposes. We improved the chemical accessibility of BioTASQ – already implemented in RNA sequencing (G4RP-seq) – and explored the influence of the spacers developing two new designs, BioCyTASQ and BioTriazoTASQ bearing alkyl and triazole linker respectively. With excellent in vitro features (FRET melting, FAM and qPCR pull-down) BioCyTASQ became the gold standard for biotinylated TASQs; while the bulkier BioTriazoTASQ showed a certain level of preference towards quadruplex RNAs isolation.To further improve the TASQ potential we replaced the biotin moiety with fully orthogonal appendages. MultiTASQ and AzMultiTASQ, bearing an alkyne and azide respectively, were used to isolate and visualize G4s in cells, using click chemistry (CuAAC and SPAAC); photoMultiTASQ, functionalized with a triple bond and a diazirine, was successfully synthesized with the premises of covalently trapping the G4 surroundings (proteins and nucleic acids) by photoactivation.We then shifted our focus on fluorescent TASQs expressly designed for cell imaging. We focus on twice-as-smart naphthalene-based probes, whose emission is dictated by G4 interaction. We revisited N-TASQ synthesis and developed TzN-TASQ comprised of triazole spacers, the latter highlighting an improved fluorescent enhancement with quadruplex RNAs. We finally focused on near infrared emitting probes based on a squaraine template. Preliminary results show how Square-TASQ v.2 exhibited strong G4 binding feature, with an emission centered around 640 nm increased upon interaction with G4.By implementing the TASQ portfolio with new design to better isolate, visualize G4s or do both with the same probe, we focus on providing molecular tools that could shed a light on the role of quadruplex.