Effet du cluster de microARN C19MC au cours des infections virales congénitales

Role of the C19MC miRNA cluster during viral congenital infections

• Auteur / Autrice : Yamileth Chin
• Direction : Cécile Malnou, Sandra López-Vergès
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 13/12/2022
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Toulousain des Maladies Infectieuses et Inflammatoires (Toulouse ; 2021-....)
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Estelle Espinos-Parrou
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Florence Margottin-Goguet, Harald Wodrich, Alexandre Favereaux

Mots clés

Mots clés contrôlés

Virus Zika

Vésicules extracellulaires

MicroARN

Mots clés libres

Virus

MiRNA

Infection congénitale

Neuronal développement

Vésicules extracellulaire

Zika

Virus

C19MC miRNA

Congenital infection

Neuronal development

Extracellular vesicles

Zika

Résumé

Les infections virales congénitales touchent les femmes du monde entier et sont associées à des troubles du développement néonatal. Par exemple, le virus Zika (ZIKV) a été associé à de graves anomalies congénitales, dont la microcéphalie. De même, le cytomégalovirus humain (hCMV) est l'infection virale la plus répandue chez le fœtus et entraîne des troubles neurodéveloppementaux. Le ZIKV et le hCMV infectent les cellules placentaires, affectant directement le développement du nouveau-né. Le placenta utilise des vésicules extracellulaires (EVs) pour interagir avec son environnement, et il a été démontré que leur contenu en microARN, notamment ceux du cluster C19MC, est dérégulé au cours des grossesses pathologiques. Le cluster de microARN C19MC, spécifique aux primates, présente un profil d'expression dynamique tout au long de la grossesse, avec des niveaux qui augmentent vers la fin du premier trimestre et chutent rapidement après la naissance. En utilisant un modèle innovant de cellules Knock-Out (KO) pour le cluster C19MC généré par la technique CRISPR/Cas9 par l'équipe de J. Cavaillé, nous avons étudié la fonction antivirale de ce cluster au cours des infections virales congénitales. Des expériences impliquant des techniques de PCR quantitative en temps réel, de western blotting, de cytométrie de flux et d'immunofluorescence ont montré que les cellules KO infectées par le hCMV et le ZIKV sont plus sensibles aux infections virales que leurs homologues sauvages (WT). De plus, des tests TCID50 et l'analyse par cytométrie de flux ont montré une infectivité virale significativement plus élevée des surnageants contenant des particules infectieuses libérées par les cellules KO infectées que par les cellules WT. Nous avons utilisé des dispositifs de qPCR RT2 profiler pour examiner les réponses immunes innées antivirales et d'autophagie des cellules KO et WT à l'infection par le ZIKV. Des différences génétiques distinctes dans l'expression suggèrent que le cluster C19MC influence la réaction à l'infection. Nous avons également exploré la possibilité d'un mécanisme d'action antiviral paracrine; nous avons testé si cet effet antiviral pouvait être transmis à des cellules réceptrices (cellules Vero) via des EVs. Les données de cytométrie en flux ont montré un impact antiviral transférable dans les cellules Vero exposées au milieu conditionné des cellules WT par rapport aux cellules KO. Néanmoins, d'autres études sont nécessaires pour confirmer ces résultats. Notre recherche offre un modèle KO unique pour évaluer la fonction multidimensionnelle du cluster de microARN C19MC au cours d'infections virales congénitales et pour déterminer s'il peut ou non fonctionner en partie par le biais des EVs. Le développement de méthodes pronostiques et thérapeutiques améliorées et plus précises repose sur une compréhension approfondie des mécanismes d'action de ce cluster.

Congenital viral infections caused by TORCH pathogens affect women worldwide and are associated with neonatal developmental disabilities. For instance, the Zika virus (ZIKV) has been linked to severe birth defects, including microcephaly. Similarly, the human Cytomegalovirus (hCMV) is the most prevalent viral infection acquired by the fetus, resulting in neurological damage. The ZIKV and the hCMV infect placental cells, directly affecting the neonate's development. In turn, the placenta employs extracellular vesicles (EVs) to interact with its environment, and it has been demonstrated that their C19MC microRNA cargo is dysregulated during pathological pregnancies. The primate-specific C19MC microRNA cluster shows a dynamic expression pattern throughout pregnancy, with levels rising toward the end of the first trimester and falling rapidly after parturition. Using an innovative Knock-Out (KO) model for the C19MC microRNA cluster generated by the CRISPR/Cas9 technique by J. Cavaillé's team, we investigated the antiviral function of this cluster during congenital viral infections. Experiments that involved real-time quantitative PCR, western blotting, flow cytometry, and immunofluorescence techniques showed that KO cells infected with the hCMV and the ZIKV are more susceptible to viral infections than their wild-type (WT) counterparts. Additionally, TCID50 assay and flow cytometry analysis showed a significantly higher viral infectivity of the supernatants containing infectious particles released from infected KO cells than from WT cells. Additionally, we used the RT2 profiler qPCR arrays to examine KO and WT cells' immunological and autophagy responses to viral infections. Distinct genetic differences in expression suggest that the C19MC cluster influences the reaction to ZIKV infections. We also explored the possibility of a paracrine antiviral mechanism of action; we tested whether or not this antiviral effect might be transmitted to recipient cells (Vero cells) via EVs. Flow cytometry data showed a transferable antiviral impact in Vero cells exposed to conditioned media from WT cells compared to KO cells. Nonetheless, more studies are required to confirm these findings further. Our research offers a unique KO-model to evaluate the multidimensional function of the C19MC miRNA cluster during congenital viral infections and whether or not it might operate in part through EVs. The development of improved and more accurate prognostic and therapeutic methods relies on a thorough understanding of the antiviral significance of this cluster.