PIKfyve, un acteur clé impliqué dans la biogénèse des granules plaquettaires, leur intégrité et leur sécrétion

PIKFyve, a new actor involved in platelet granule biogenesis, their integrity and secretion

• Auteur / Autrice : Manuella Caux
• Direction : Sonia Séverin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physiopathologie
• Date : Soutenance le 18/02/2022
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Maladies Métaboliques et Cardiovasculaires (Toulouse ; 2011-....)
• Jury : Président / Présidente : Muriel Laffargue
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Bernard Payrastre
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Alexandre Kauskot, Catherine Léon, Sylvie Friant

Mots clés

Mots clés contrôlés

Thrombose

Phospho-inositides

Plaquettes sanguines

Mots clés libres

Plaquettes sanguines

Granules

Phosphoinositides

Thrombose

Platelets

Granules

Phosphoinositides

Thrombosis

Résumé

La sécrétion des granules plaquettaires est un mécanisme finement régulé et crucial pour les fonctions plaquettaires hémostatiques/thrombotiques afin d'empêcher le saignement lors d'une lésion vasculaire. Les granules alpha et denses sont des organelles plaquettaires spécifiques, formés dans le mégacaryocyte (MK), progéniteur des plaquettes, au cours de leur différenciation. Néanmoins, les mécanismes moléculaires impliqués dans les différentes étapes de la biologie des granules plaquettaires comme la biogenèse, le maintien de leur intégrité, mais aussi leur sécrétion restent encore mal définis dans les MKs et les plaquettes. Ces processus impliquent un trafic intravésiculaire et une dynamique de remodelage membranaire, processus connus pour être régulés par des phosphoinositides (PI). En effet, au cours des dernières années les PIs, finement régulés par des jeux de kinases et phosphatases spécifiques, se sont révélés être des acteurs majeurs dans de nombreux mécanismes cellulaires comme la signalisation cellulaire, le remodelage du cytosquelette ou encore le trafic intracellulaire. Toutefois, leur implication dans la biologie des granules dans les MKs et les plaquettes reste encore à découvrir. Au cours de ma thèse, j'ai étudié le rôle de la PI-5-kinase PIKfyve, générant du PtdIns5P et du PtdIns(3,5)P2 à partir de PtdIns et PtdIns3P respectivement, dans la biologie des granules dans le MK et la plaquette. Nos résultats montrent que PIKfyve est responsable de la production de PtdIns5P et de PtdIns(3,5)P2 dans le MK, et que son expression augmente au cours de la différenciation du MK. De plus, l'inhibition pharmacologique de PIKfyve ou son invalidation par shRNA dans les lignées mégacaryocytaires MEG-01 et imMKCL ainsi que dans des MKs murins différenciés in vitro à partir de progéniteurs hématopoïétiques, induit l'apparition de larges vésicules cytoplasmiques. Ces larges structures sont composées de molécules spécifiques des granules alpha et des granules denses et présentent une perte de mobilité. De façon intéressante, l'ajout de PtdIns5P ou de PtdIns(3,5)P2 perméants suite à l'inhibition de PIKfyve dans les MEG-01 permet de restaurer un phénotype granulaire normal avec une ségrégation des larges vacuoles en granules alpha et denses intègres et une mobilité normale des granules. Dans les plaquettes, l'inhibition pharmacologique de PIKfyve induit l'apparition de larges structures positives uniquement pour les marqueurs de granules denses, probablement résultant de fusion de vésicules entre elles, tandis que les granules alpha ne sont pas affectés. Ce défaut d'ultrastructure est associé à une sécrétion défectueuse du contenu des granules denses en réponse à différents agonistes et à une diminution des capacités thrombotiques des plaquettes, montrée par une diminution de l'agrégation plaquettaire à faible doses d'agonistes et la formation de thrombi moins gros sur matrice de collagène en condition de flux artériel. Ainsi, mes travaux soulignent le rôle majeur de PIKfyve et de ses deux produits dans la biogénèse des granules et leur identité dans le MK, mais aussi son implication dans le maintien de l'intégrité des granules denses permettant des fonctions plaquettaires thrombotiques normales.

Platelet granule secretion is a highly regulated and fine-tuned mechanism crucial for hemostatic/thrombotic platelet functions to prevent bleeding during vascular injury. Alpha and dense granules are specific platelet organelles formed in the megakaryocyte (MK), progenitors of platelets, during their differentiation. Nevertheless, the molecular mechanisms involved in the different stages of the platelet granule biology such as biogenesis, the maintenance of their integrity, but also their secretion are still poorly defined in MKs and platelets. These processes involve a fine- tuned intravesicular trafficking and membrane remodeling dynamics, processes known to be regulated by phosphoinositides (PI). PI, finely regulated by specific kinases and phosphatases, have turned out to be major players in numerous cellular mechanisms such as cell signaling, cytoskeletal remodeling or even intracellular trafficking. However, their implication in the granule biology in MKs and platelets remains to be discovered. During my thesis, I studied the role of the PI-5-kinase PIKfyve, generating PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 from PtdIns and PtdIns3P respectively, in the biology of granules in MK and platelets. Our results show that PIKfyve is responsible for the production of PtdIns5P and PtdIns(3,5)P2 in MK, and that its expression increases during MK differentiation. In addition, the pharmacological inhibition of PIKfyve or its invalidation by shRNA in the megakaryocytic lines MEG-01 and imMKCL as well as in murine MKs differentiated from hematopoietic progenitors in vitro, induce the appearance of large cytoplasmic vesicles. These large structures are composed of specific molecules for alpha granules and dense granules and exhibit a loss of mobility. Interestingly, the addition of permeant PtdIns5P or PtdIns(3,5)P2 following the inhibition of PIKfyve in MEG-01 restore a normal granular phenotype with a segregation of the large vacuoles into alpha and dense granules and normal mobility of the granules. In platelets, pharmacological inhibition of PIKfyve induces the appearance of large structures only positive for dense granule markers, possibly resulting from fusion of vesicles with each other, while alpha granules are unaffected. This ultrastructural defect is associated with a defective secretion of the contents of dense granules in response to different agonists and a decrease in the thrombotic capacities of platelets, shown by a decrease in platelet aggregation at low doses of agonists and the formation of smaller thrombi on collagen matrix under arterial flow condition. Thus, these data underline the major role of PIKfyve and its two products in the biogenesis of granules and their identity in MK, but also its role in maintaining the integrity of dense granules allowing normal thrombotic platelet functions.