Assemblage et dysfonctionnement de ribosomes mammifères : une étude structure-fonction par cryo-MET

Assembly and dysfunction of mammalian ribosomes : a structure/function study by cryo-EM

• Auteur / Autrice : Laura Plassart
• Direction : Célia Plisson-Chastang, Pierre-Emmanuel Gleizes
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et fonctionnelle
• Date : Soutenance le 28/03/2022
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité de biologie moléculaire, cellulaire et du développement (Toulouse ; 2021-....)
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Axel Innis, Sébastien Ferreira-Cerca, Kerstin Bystricky
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Angelita Simonetti, François Bachand

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cryomicroscopie

Ribosomes

Mots clés libres

Ribosomes

Cryo-MET

Biogénèse des ribosomes

Cancer

Étude structure/fonction

Ribosomes

Cryo-EM

Ribosome biogenesis

Cancer

Structure/function study

Résumé

Le ribosome, qui traduit le code génétique en protéines, est une machinerie moléculaire essentielle au fonctionnement optimal des cellules. La formation, ou biogenèse, de ces ribosomes est un processus très complexe, qui doit être finement contrôlé et régulé pour produire rapidement des sous-unités ribosomiques matures et fonctionnelles. Des mutations dans des composants de cet appareil cellulaire essentiel sont à l'origine de diverses maladies, comme des anémies, des retards de croissance mais aussi certains cancers. Dans ce contexte, la caractérisation précise de l'ensemble des mécanismes d'assemblage et de fonctionnement des ribosomes en conditions normales et pathologiques devient un enjeu primordial. Ces questions scientifiques ont récemment connu des avancées majeures, notamment grâce à l'utilisation de la cryo-microscopie électronique (cryo-EM). En effet, couplée à des analyses fonctionnelles, la résolution de différents états structuraux du ribosome a permis la description de nombreux mécanismes moléculaires responsables de la biogenèse des ribosomes, ainsi que de différentes étapes de la traduction. Mon projet de thèse s'inscrit pleinement dans ces analyses structure/fonction de l'assemblage et du fonctionnement des ribosomes. Mon premier projet de thèse s'est focalisé sur les étapes finales de la maturation de la petite sous-unité ribosomique humaine, aussi appelée sous-unité 40S. Pour cela, en me basant sur des analyses structurales par cryo-EM, j'ai mené des études fonctionnelles sur des particules pré-40S purifiées à une étape tardive de leur maturation, grâce à la forme catalytiquement inactive de l'ATPase RIO1. Ce travail m'a permis de mettre en évidence les rôles combinés de RIO1 et de la protéine ribosomique RPS26 dans le déclenchement du clivage du pré-ARNr 18S-E par l'endonucléase NOB1, entrainant la maturation finale de l'ARNr 18S. Mon second projet de thèse visait à comprendre les effets d'une mutation ponctuelle de la protéine ribosomique RPS15 (mutation RPS15-P131S) sur les mécanismes de traduction. Des mutations ponctuelles dans le domaine C-terminal de cette protéine de la petite sous-unité ribosomique sont en effet retrouvées dans de nombreux cas de leucémies et de tumeurs solides. Pour cela, j'ai entamé une analyse structure/fonction de ces ribosomes mutants. J'ai purifié et déterminé par cryo-EM les structures 3D de ribosomes en cours de traduction. J'ai comparé les structures de ribosomes '' sauvages '' à leurs homologues mutants, portant la mutation RPS15-P131S. Mes résultats montrent que la mutation provoque la déstabilisation structurale du domaine C-terminal de RPS15, ce qui entraînerait un ralentissement de l'étape d'élongation de la traduction. Une hypothèse pour expliquer ce phénomène serait que la déstructuration du domaine C-ter de RPS15 empêche l'accommodation correcte des ARNt amino-acylés dans le site A du ribosome.

The ribosome, which translates the genetic code into proteins, is an essential molecular machinery for the optimal functioning of cells. The formation, or biogenesis, of these ribosomes is a very complex process, which must be finely tuned to rapidly produce mature and functional ribosomal subunits. Mutations in components of this essential cellular apparatus are at the origin of various diseases, such as anemia, growth retardation but also some cancers. In this context, the precise characterization of the assembly and functioning mechanisms of ribosomes in normal and pathological conditions becomes crucial. This topic has recently seen major advances, notably thanks to the use of cryo-electron microscopy (cryo-EM). Indeed, coupled with functional analyses, the resolution of different structural states of ribosomes or precursors of ribosomal subunits has allowed to describe many molecular mechanisms responsible for ribosome biogenesis, as well as different steps of translation. My thesis project is fully in line with these structure/function analyses of ribosome assembly and function. My first thesis project focused on the final maturation steps of the human small ribosomal subunit, also called 40S subunit. For this purpose, based on structural analysis by cryo-EM, I conducted functional studies on pre-40S particles purified at a late stage of their maturation, thanks to a tagged and catalytically inactive form of the ATPase RIO1. This work allowed to demonstrate the combined action of both RIO1 with the ribosomal protein RPS26 in triggering the cleavage of the pre-rRNA 18S-E by the NOB1 endonuclease, leading to the final maturation of 18S rRNA. My second thesis project aimed at understanding the effects of a point mutation in the ribosomal protein RPS15 (S15-P131S mutation) on translation mechanisms. Point mutations in the C-terminal domain of this protein of the small ribosomal subunit are indeed found in many cases of leukemia and solid tumors. For this purpose, I initiated a structure/function analysis of these mutant ribosomes. I purified and determined the cryo-EM 3D structures of translating ribosomes. I compared the structures of wild type ribosomes to their mutant counterparts, carrying the S15-P131S mutation. My results show that the mutation causes structural destabilization of the C-terminal domain of RPS15, which results in a slowing down of the elongation step of translation. One hypothesis to explain this phenomenon would be that the destructuring of the C-terminal domain of RPS15 prevents the proper accommodation of aminoacylated tRNAs in the A-site of the ribosome.