Les protéines pariétales à domaine PAC dans la lignée verte : rôle dans l'architecture des parois cellulaires

PAC domain proteins in the green lineage : role in plant cell wall architecture

• Auteur / Autrice : Hasan Kolkas
• Direction : Elisabeth Jamet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Développement des plantes, interactions biotiques et abiotiques
• Date : Soutenance le 05/04/2022
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Recherche en Sciences Végétales (Toulouse ; 2010-....)
• Jury : Président / Présidente : Chantal Teulières
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Elisabeth Jamet, Aurélien Boisson-Dernier
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Christoph Ringli, Godfrey Neutelings

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéomique végétale

Marchantia

Paroi cellulaire végétale

Mots clés libres

Marchantia polymorpha

Protéomique

Paroi cellulaire

Interactions protéine-protéine -

CRISPR-Cas9

Fret-flim

Marchantia polymorpha

Proteomics

Plant cell wall

Protein-protein interaction

CRISPR-Cas9

Fret-flim

Résumé

Les parois cellulaires végétales sont le principal composant de la biomasse végétale. Elles sont principalement composées de polysaccharides (~90 %), de protéines (~5-10 %) et de composés phénoliques. Les protéines de la paroi cellulaire (CWP) jouent un rôle majeur dans la plasticité de la paroi cellulaire au cours du développement et en réponse à un stress. Le premier objectif de ma thèse était de caractériser le protéome de la paroi cellulaire des thalles de la bryophyte Marchantia polymorpha, en analysant trois étapes du développement. Deux types d'extraction de protéines ont été réalisés : (i) en utilisant des solutions salines pour éluer les protéines des parois purifiées ; (ii) par chromatographie d'affinité sur concanavaline A à partir de protéines totales. Après LC-MS/MS et analyse bioinformatique, 410 CWP avec des peptides signaux prédits ont été identifiés. Le protéome de la paroi cellulaire de M. polymorpha présente certaines spécificités par rapport à celui des plantes vasculaires, mais également des caractéristiques conservées. Parmi les protéines agissant sur les polysaccharides, on trouve des glycosides hydrolases des familles GH16 (XTH), 17 (ß-1,3- glucanase), 18 (chitinase) et 19 (chitinase/lysozyme). L'abondance oxydo-réductases, telles que les peroxydases de classe III et les polyphénol oxydases, est probablement liée à la présence de composés aromatiques dans les parois. Des dirigent proteins qui peuvent être impliquées dans la polymérisation de composés aromatiques sont très représentées ainsi que des D-mannose lectines. Par ailleurs, une extraction différentielle des polysaccharides a permis de révéler plusieurs types de polysaccharides grâce à des anticorps spécifiques: (i) l'acide homogalacturonique faiblement méthylestérifié ; (ii) des xyloglucanes de type XXXG et XXLG ; (iii) du mannane et du galactomannane. Le deuxième objectif de ma thèse était d'étudier les deux protéines pariétales à domaine PAC (Pro-rich protein, Arabinogalactan protein, Conserved Cys) (PDP) de M. polymorpha (Mp1g10970 et Mp1g29680). Ces protéines sont présentes dans toutes les plantes terrestres. On supposait auparavant que AtAGP31, une PDP d'A. thaliana, était impliquée dans des interactions non covalentes avec des polysaccharides pectiques (galactanes) et son propre domaine central O-glycosylé pour former des réseaux supra-moléculaires. Notre étude visait à comprendre le rôle des deux PDP de M. polymorpha au cours du développement du thalle par des approches de génétique inverse. De même, nous avons également voulu répondre à la question de la conservation du rôle des PDP dans l'évolution de la lignée verte. Nous avons obtenu des lignées transgéniques sur-exprimant Mp1g10970 et Mp1g29680 ainsi que des mutants knock-out en utilisant la technologie CRISPR-Cas9. Ces mutants ont été génotypés et nous avons observé une réduction de la croissance des thalles correspondant à une réduction du nombre de cellules et une génération plus précoce des corbeilles à propagules chez les sur-expresseurs. Enfin, ce travail a contribué à la mise en place de la technique FRET-FLIM pour étudier les interactions protéine-protéine in muro, ce qui a permis de démontrer l'interaction entre le domaine PAC et le domaine central O-glycosylé d'AtAGP31.

Plant cell walls are the major components of the plant biomass. They are mainly composed of polysaccharides (~90%), a wide variety of proteins (~5-10 %), and phenolic compounds. Cell wall proteins (CWPs) play major roles in cell wall plasticity during development and upon stress. The first objective of my thesis was to characterize the cell wall proteome of a Bryophyte, Marchantia polymorpha. Three stages of thallus development were analyzed. Two types of protein extraction were performed: (i) using salt solutions from purified walls; and (ii) by affinity chromatography on Concanavalin A from total proteins. Altogether, 410 CWPs with predicted signal peptide were identified after LC-MS/MS and bioinformatics analyses. The M. polymorpha cell wall proteome exhibits some specificities compared to that of vascular plants, but also conserved features. Among the proteins acting on polysaccharides, glycoside hydrolases of the GH16 (XTHs), 17 (ß-1,3- glucanases), 18 (chitinases) and 19 (chitinases/lyzozymes) families were present. Oxido-reductases, such as class III peroxidases and polyphenol oxidases, were well-represented probably in relation to the accumulation of aromatic compounds in the cell walls. Numerous dirigent proteins possibly involved in the polymerization of aromatic compounds were also present. Lectins targeting D-mannose were remarkably present among the identified proteins with interaction domains. To complement this work, differential extractions of polysaccharides from the walls were carried out. Using polysaccharide arrays, specific antibodies allowed the detection of three types of polysaccharides in abundance: (i) poorly methylesterified homogalacturonans; (ii) xyloglucans of the XXXG and XXLG types; and (iii) mannans and galactomannans. The second objective of my thesis was to study the two cell wall PAC ((Pro-rich proteins, Arabinogalactan proteins, Conserved Cysteines) domain proteins (PDPs) of M. polymorpha. (Mp1g10970 and Mp1g29680). The PAC domain is conserved in all the terrestrial plants. It was previously assumed that the Arabidopsis thaliana protein AtAGP31 is involved in non- covalent interactions with pectic polysaccharides (galactans) and with its own central O- glycosylated domain. Our study aimed at understanding the role(s) of PDPs during M. polymorpha development by deploying reverse genetic studies. In the same manner, we also wanted to answer the question of the conservation of the role(s) of PDPs during the evolution of the green lineage. We have obtained transgenic over-expressor lines and KO mutants using the CRISPR-Cas9 technology. The genotyping of these mutants has been carried out and their phenotyping has shown a significant reduction in growth and an earlier production of gemma cups. Finally, this work has contributed to the establishment of the FRET-FLIM technology to study protein-protein interactions in cell walls, with the aim of demonstrating the interaction between PAC domains and the central O-glycosylated domain of AtAGP31 in muro.