Profilage de l'ubiquitylation des protéines dans les cellules résistantes au bortézomib : rôle des enzymes de ubiquitylation

Protein ubiquitylation profiling in bortezomib resistant cells : role of ubiquitin enzymes

• Auteur / Autrice : Maria Gonzalez Santamarta
• Direction : Manuel Rodriguez, Dimitris Xirodimas
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Cancérologie
• Date : Soutenance le 18/02/2022
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de chimie de coordination
• Jury : Président / Présidente : Karine Reybier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Manuel Rodriguez, Dimitris Xirodimas
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Nicolas Bidère, Guillaume Bossis, Daniel Taillandier

Mots clés

Mots clés contrôlés

Lymphome du manteau

Ubiquitine

Protéasome

Mots clés libres

Ubiquitine

Système protéasome

Autophagie

Lymphome à cellules du manteau

Bortézomib

Ubiquitin

Proteasome System

Autophagy

Mantle Cell Lymhpoma

Bortezomib

Résumé

L’altération de la protéostase peut être la cause ou conséquence de pathologies comme le lymphome à cellules du manteau (MCL), lymphome non-hodgkinien agressif avec un faible taux de survie et des rechutes après un traitement par l'inhibiteur de protéasome Bortezomib (BTZ). Les voies Ubiquitine-protéasome (UPS) et autophagie-lysosome (ALS) reposent sur l'Ubiquitine (Ub) pour la dégradation intracellulaire des protéines au sein d’un seul réseau protéolytique coordonné. A l’aide de pièges à Ub (TUBEs) associés à la spectrométrie de masse (MS) pour comparer le protéome de l'Ub de la lignée cellulaire MCL résistante au BTZ (ZBR) et de son homologue parental (Z138), notre équipe a découvert que l’Ub joue un rôle dans la réponse au BTZ et dévoilé un passage moléculaire de l'UPS à l'ALS, décrivant la protéaphagie comme une caractéristique de la résistance au BTZ. On observe également un enrichissement des chaînes d'Ub K63 dans la lignée ZBR. Notre hypothèse est que cet enrichissement pourrait la prédisposer à activer l'autophagie et les événements de signalisation liés à la résistance au BTZ, le but étant d’identifier le mécanisme et protéines impliqués. A cette fin, nous avons identifié le protéome d'Ub associé aux chaînes d'Ub K63 et K48 des cellules Z138/ZBR. Des traitements chimiques combinatoires permettent en outre de bloquer les enzymes E3 enrichies dans ZBR (TRIM24, UBR2, UBR4 et UBR5) et le récepteur d'autophagie p62. TRIM24 est plus enrichi dans les cellules ZBR aux niveaux basaux. Sa stabilité est compromise différemment dans les cellules Z138 et ZBR après inhibition du protéasome ou de l'autophagie en utilisant la Bafilomycine A (BafA), suggérant qu’elle joue un rôle dans la diaphonie UPS-ALS. Nous avons utilisé dTRIM24, une chimère validée ciblant la protéolyse (PROTAC) pour cibler TRIM24 dans nos modèles. Un traitement dTRIM24/ZBR réduit le protéasome et favorise les effets apoptotiques coopératifs dans les cellules ZBR. Leur traitement par dTRIM24 favorise la formation des chaînes K48 et K63 et la fraction associée à l'Ub de p62 et des sous-unités du protéasome. Les protéines UBR participent à la régulation de la voie de la règle N-end, qui cible le protéome Arg pour la dégradation via le domaine ZZ du récepteur d'autophagie p62/SQSTM1 en situation de stress protéotoxique. La vertéporfine (VTP) induit fortement l'apoptose des cellules ZBR, seule ou en combinaison avec le BTZ. Comme la VTP induit des espèces ROS, nous avons utilisé un inhibiteur du domaine ZZ de la p62 (XRK3F2) pour explorer le rôle de la p62 sur les enzymes UBR. Nous avons constaté que XRK3F2 a un impact différent sur la stabilité des enzymes UBR dans les cellules ZBR et Z138. La viabilité des cellules Z138 et ZBR est similaire lors d'un traitement individuel ou combiné au BTZ, ce qui suggère que les changements dans les niveaux de protéines des enzymes UBR ne sont pas associés à la résistance au BTZ et que la VTP est un meilleur traitement pour augmenter l'apoptose dans les cellules ZBR.Pour mieux comprendre la réponse à la VTP dans les cellules résistantes au BTZ, nous avons caractérisé les nanobodies spécifiques des chaînes K48 et K63 avec Hybrigenics (outils commercialisés par Nanotag). Après avoir établi les conditions pour les nanobodies-précipitations (NP), le protéome d'Ub des cellules ZBR et Z138 traitées ou non avec la VTP a été analysé par MS. Les résultats confirment l’enrichissement des chaînes K63 dans ZBR, fournissant une liste de protéines candidates jouant un rôle dans la résistance au BTZ.

Disruption of proteostasis is often the cause or consequence of pathologies, including haematological malignancies like Mantle Cell lymphoma (MCL). MCL is an aggressive non-Hodgkin lymphoma, with a poor rate of survival and frequent relapses after Bortezomib (BTZ) treatment. The two major intracellular degradation pathways, the Ubiquitin-proteasome (UPS) and autophagy-lysosome (ALS) systems, rely on Ubiquitin (Ub) to drive protein degradation acting as a single coordinated network. Using Ub traps (TUBEs) associated to mass spectrometry (MS) to compare the Ub proteome of the BTZ-resistant MCL cell line (ZBR) and its parental BTZ-sensitive counterpart (Z138), the hosting lab found Ub playing a major role in BTZ response/resistance and unveiled a molecular switch from UPS to ALS, describing proteaphagy as a hallmark of resistance. K63 Ub chains and other enzymes were also detected enriched in ZBR in this analysis. We hypothesized that this enrichment could predispose them to activate autophagy and signaling events implicated in MCL cell survival and BTZ resistance, being focused on the identification of mechanism and proteins directly involved. To explore this hypothesis, we used several experimental strategies including the isolation and identification of the Ub proteome, and the used of combinatorial chemical treatments. TRIM24, which is known to regulate the activity of the tumor suppressor p53, was found more enriched in ZBR cells at basal levels. TRIM24 stability is compromised differently after inhibition of the proteasome (BTZ) or autophagy using Bafilomycin A (BafA), in Z138 and ZBR cells suggesting a possible role in UPS-ALS crosstalk. We have used dTRIM24, a validated Proteolysis Targeting Chimeric (PROTAC) to target TRIM24 in our MCL model. Our results show that a combined dTRIM24/ZBR treatment reduces proteasome levels and promotes cooperative apoptotic effects in the ZBR cell line. Interestingly, a dTRIM24 treatment enhanced the formation of K48 and K63 chains and the Ub-associated fraction of p62 and proteasome subunits in ZBR cells. UBR proteins (UBR2, UBR4 and UBR5 found enriched in ZBR) are involved in the regulation of the N-end rule pathway, related to the ZZ domain of the autophagy receptor p62/SQSTM1 under proteotoxic stress conditions. Verteporfin (VTP), one of the most effective p62 inhibitors, strongly induces apoptosis in ZBR cells. However, since VTP also induces ROS (oxygen-containing reactive species), we used an inhibitor of the p62 ZZ domain (XRK3F2) to further explore the role of p62 and its impact on UBR enzymes. We found that XRK3F2 differently affects the stability of UBR enzymes in ZBR compared to Z138 cells. However, the viability of Z138 and ZBR cells was similar, suggesting that changes in protein levels of UBR enzymes are not associated to BTZ resistance and that VTP is a better treatment to enhance apoptosis in ZBR cells. To better understand the response to VTP in BTZ-resistant cells, we collaborated with Hybrigenics to characterise K48 and K63 Ub chain specific nanobodies (now commercialised by Nanotag).