De l’analyse fonctionnelle d’ARNt nucléotidyltransférases vers leur caractérisation par cristallographie sérielle sous rayonnement X

From functional study of tRNA CCA-adding enzymes toward their characterization by serial X-ray crystallography

• Auteur / Autrice : Kévin Rollet
• Direction : Claude Sauter, Mario Mörl
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biophysique et biologie structurale
• Date : Soutenance le 17/03/2022
• Etablissement(s) : Strasbourg en cotutelle avec Universität Leipzig
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Architecture et réactivité de l'ARN (Strasbourg ; 1992-....)
• Jury : Président / Présidente : Patrick Schultz
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Irene Coin
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marie-Hélène Ledu, André Schneider

Mots clés

Mots clés contrôlés

Structure

Complexes multienzymatiques

ARN de transfert

Radiocristallographie

Mots clés libres

Cristallographie aux rayons X

Cristallographie sérielle

ARNt nucléotidyltransférase

Cristallisation

Macromolécules biologiques

Xtal Controller

Organisme psychrophile

X-ray crystallography

Serial crystallography

TRNA nucleotidyltransferase

Macromolecule crystallization

Xtal Controller

Psychrophilic organism

Résumé

La dernière décennie marque d'importantes évolutions dans le domaine de la biologie structurale, en particulier dans la cristallographie sérielle aux rayons X résolue en temps. L’objectif de cette thèse en cotutelle entre les universités de Strasbourg et de Leipzig, était d’appliquer cette approche à la caractérisation fonctionnelle et structurale de trois CCA-adding enzymes. En combinant résultats biochimiques et méthodes de cristallisation avancées, nous avons pu : 1) déterminer l'affinité de liaison de nos candidats à divers substrats ainsi que les propriétés cinétiques des réactions catalysées , 2) obtenir des conditions reproductibles de production de cristaux pour les analyses standard et SSX,3) suivre les événements de nucléation et contrôler la cristallisation de certaines enzymes grâce au Xtal Controller, 4) acquérir des données sérielles in situ à température ambiante en puce microfluidique, 5) résoudre la structure d’une cible dans sa forme apo ou en complexe avec un ligand.

The last decade has seen important developments in the field of structural biology, in particular in time-resolved serial X-ray crystallography (TR-SSX). The objective of this thesis, in cotutelle between the universities of Strasbourg and Leipzig, was to apply this approach to the functional and structural characterization of three CCA-adding enzymes. By combining biochemical results and advanced crystallization methods, we were able to: 1) determine the binding affinity of our candidates to various substrates as well as the kinetic properties of the catalyzed reactions, 2) obtain reproducible crystal production conditions for standard and SSX analyses, 3) monitor nucleation events and control the crystallization of selected enzymes using the Xtal Controller, 4) acquire serial data in situ at room temperature in microfluidic chip, 5) resolve the structure of a target in its apoform or in complex with a ligand.