Accroître le potentiel des mimes de superoxyde dismutase comme traitement des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin : de leur conception et production à leur administration intestinale chez la souris

Boosting the potential of superoxide dismutase mimics as treatment for inflammatory bowel diseases : from chemical design and production to intestinal delivery in mice

• Auteur / Autrice : Gabrielle Schanne
• Direction : Nicolas Delsuc, Philippe Seksik
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie moléculaire
• Date : Soutenance le 16/12/2022
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Chimie moléculaire de Paris centre (Paris ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire des biomolécules (Paris ; 2009-....)
• Jury : Président / Présidente : Fabienne Burlina
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Benedicte Arnaud-Pigneur
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Olivier Espéli, Christelle Hureau

Mots clés

Mots clés contrôlés

Souris de laboratoire

Stress oxydatif

Maladies inflammatoires chroniques de l'intestin

Complexes métalliques

Lactobacillales

Superoxyde dismutase

Mots clés libres

Mimes de superoxyde dismutase

Complexes métalliques

Bactéries lactiques recombinantes

Superoxide dismutase mimics/mimetics

Metallic complexes

Recombinant lactic acid bacteria

Résumé

Les superoxide dismutases (SODs) sont des metalloenzymes qui jouent un rôle important dans les défenses cellulaires anti-oxydantes en régulant la concentration en ion radical superoxide, un dérivé réactif de l’oxygène (DRO). Il a été montré que les SODs, et les défenses anti-oxydantes en général, sont déficientes chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). Il en résulte une augmentation de la concentration en DRO qui semblerait être impliquée dans la pathogénèse des MICI. L’utilisation de complexes métalliques à faible poids moléculaire mimant l’activité SOD pourrait donc constituer une solution prometteuse pour le traitement des MICI. Deux sortes de mimes de SOD ont été étudiées ici : 1) des mimes bio-inspirés de la SOD2 endogène et 2) des complexes peptidiques à base de Cu et Mn. Dans le premier cas, une stratégie biomimétique a été suivie et a conduit au développement de Mn1, un complexe de Mn reproduisant le site actif de la SOD2 et son activité. Ce composé a une activité anti-inflammatoire sur cellules et sur modèle murin. Cependant, Mn1 est très flexible, ce qui favorise la décoordination du Mn qui peut s’échanger avec d’autres cations. Dans le but de s’affranchir des problèmes d’échanges métalliques et déprotonation, des groupements cyclohexyle (C) et propyl (P) ont été ajoutés. Le groupe cyclohexyle a été introduit de sorte à rigidifier la structure du complexe pour améliorer son inertie. Les complexes Mn1C, Mn1P et Mn1CP obtenus possèdent une activité SOD légèrement améliorée mais surtout une résistance fortement accrue aux échanges métalliques. De plus, ils sont capables d’exercer des effets anti-inflammatoires et anti-oxydants à plus faible dose que Mn1 sur un modèle de cellules intestinales stimulées au LPS. Cela peut être corrélé au moins en partie à leur plus grande inertie dans l’environnement cellulaire. La détection et la quantification des espèces actives sont indispensables pour comprendre et rationaliser les activités observées in cells. Cependant, elles ne sont pas évidentes pour de tels composés labiles qui peuvent souffrir d’échanges métalliques au sein des systèmes analytiques. En lien avec sa meilleure inertie, nous avons pu détecter et quantifier la présence de Mn1CP dans les cellules par spectrométrie de masse (MS). Cette technique ne permettait pas la détection de Mn1 et Mn1P, qui a nécessité le couplage de la spectrométrie de mobilité ionique avec la MS. Par ailleurs, nous avons étudié la localisation intracellulaire de Mn1 et Mn1CP et en particulier leur capacité à atteindre les mitochondries, principaux foyers cellulaires du stress oxydant, par microscopie de fluorescence aux rayons X. Dans ce but, une sonde à base de Re ciblant les mitochondries a été développée et utilisée. Enfin, le potentiel thérapeutique des mimes a été évalué sur un modèle murin de colite aigüe. Les complexes de Mn ont été vectorisés dans des bactéries lactiques afin de les protéger de l’acidité gastrique lors de leur administration orale. L’administration par gavage de Mn1C a permis de légèrement réduire la sévérité de la colite. Concernant le second type de mimes de SOD, ils sont constitués de ligands peptidiques qui présentent l’avantage d’être génétiquement encodables. De cette façon, des bactéries lactiques ont été modifiées génétiquement de sorte à exprimer ces peptides qui possèdent une activité SOD après coordination du cuivre ou du manganèse. La construction génétique a été vérifiée à trois niveaux : contrôle de la présence du gène, vérification de l’expression du peptide cloné et de son activité SOD en présence du métal adéquat. De plus, la co-incubation de cellules intestinales avec les bactéries lactiques recombinantes s’est montrée ici encore efficace pour limiter la sécrétion d’interleukin-8, une cytokine pro-inflammatoire, induite par le LPS. Les bactéries servent alors à la fois de vecteur de délivrance protecteur et d’usine de production des mimes de SOD.

Superoxide Dismutases (SODs) are metalloenzymes involved in the cellular antioxidant defenses. They regulate the concentration of the superoxide anion, a reactive oxygen species (ROS). It has been shown that SOD and others antioxidant defenses are weakened in patients with chronic inflammatory bowel diseases (IBDs). The resulting increase in ROS amount may contribute to the pathogenesis in IBDs. Low-molecular weight complexes, mimicking SOD activity, may be promising antioxidant metallodrugs for the management of IBDs. Two kinds of SOD mimics were considered here, 1) bio-inspired Mn complexes and 2) peptidyl Cu or Mn complexes. On the one hand, a biomimetic strategy has led to the development of Mn1, a Mn complex reproducing SOD2 active site and its SOD activity and showing an anti-inflammatory activity in cells and in mice. However, Mn1 being flexible is prone to metal-assisted dissociation in biological environment. Aiming at improving its bioactivity and at preventing any deprotonation issue during the subsequent speciation studies, a cyclohexyl (C) and a propyl (P) groups were included in its structure. More precisely, the cyclohexyl group was introduced to rigidify the ligand and thus to improve the kinetic inertness of the resulting Mn1C and Mn1CP complexes. Mn1P, Mn1C and Mn1CP demonstrated slightly higher intrinsic SOD activity and a slower kinetics of metal exchanges. Very interestingly, they were shown to provide anti-inflammatory and antioxidant effects in intestinal LPS- stressed epithelial cells at lower doses than Mn1. This can be at least partly correlated to their higher inertness in the cellular environment. The understanding of the SOD mimics bioactivities can be boosted by the direct detection and quantification of the active species inside the cells, which is not straightforward due to their propensity to exchange metal ions, in particular in the analytical systems. Because of its higher kinetic inertness, Mn1CP was successfully detected inside cell lysates by classical mass spectrometry (MS), and its intracellular concentration was estimated. On the contrary, the more labile Mn1 and Mn1P complexes were not detected by this technique. Very interestingly, coupling ion mobility and MS allowed us to successfully detect and quantify Mn1P in cells. Besides the cellular uptake, the intracellular location of the SOD mimics is a key factor for bioactivity. The distribution of Mn1 and Mn1CP within cells and in particular their ability to reach the mitochondria, regions rich in ROS, were examined by X-ray fluorescence microscopy. For this purpose, we developed and used a mitochondria-targeting X-ray probe bearing a Re. Lastly, the bioactivity of Mn1 derivatives was investigated in a murine model of acute colitis. To protect the Mn complexes from decoordination and degradation in the acidic gastric conditions upon oral administration, they were vectorized inside food-grade bacteria. The mice that orally received Mn1C by gavage showed a slightly better recovery than mice from the control group. On the other hand, SOD mimics based on peptidyl ligands are advantageously genetically encodable. In this way, food-grade lactic acid bacteria were engineered to express and secrete the peptidyl ligand of Mn- or Cu-based SOD mimics. One peptide developed as a Cu-complex catalase mimic was also studied, catalase being an antioxidant protein controlling the hydrogen peroxide concentration, another deleterious ROS. The engineering was checked at three levels: sequencing of the cloned gene, expression of the encoded peptides and SOD activity of the expressed peptides upon metal coordination. Interestingly, the recombinant lactic acid bacteria producing either the Cu or Mn peptidyl SOD mimics were efficient in limiting the secretion of interleukin-8 inflammatory marker in LPS-stimulated intestinal cells. The bacteria hence serve as both protective delivery vectors and production factories of the SOD mimics.