Mécanisme moléculaire de l'adhésion des balanes : approche structurale et biochimie sous-jacente

Molecular mechanism of barnacle adhesion : a structural approach and underlying biochemistry

• Auteur / Autrice : Sunyoung Hur
• Direction : Souhir Boujday, Ali Miserez
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physique et chimie des matériaux
• Date : Soutenance le 01/12/2022
• Etablissement(s) : Sorbonne université en cotutelle avec Nanyang Technological University (Singapour)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Physique et chimie des matériaux (Paris ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de réactivité de surface (Paris ; 1985-....)
• Jury : Président / Présidente : Dalton Tay Chor Yong
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jing Yu, Thierry Azaïs, Guylène Costentin
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Marité Cárdenas Gómez, Patrick Flammang

Mots clés

Mots clés contrôlés

Minéralisation (biologie)

Molécules d'adhésivité cellulaire

Balanes

Mots clés libres

Protéines de ciment de balane

Adhésion en surface

Biominéralisation

Barnacle cement proteins

Surface adhesion

Biomineralization

Résumé

Les balanes adhèrent de manière robuste et permanente à divers substrats sous-marins grâce à de fortes interactions d’une couche complexe multiprotéique appelée « ciment ». Cependant, les interactions intermoléculaires responsables des fortes propriétés adhésives du ciment de bernacle restent mal comprises. Une hypothèse centrale de cette thèse est que les propriétés sous-marines du complexe cimentier sont intimement liées aux caractéristiques moléculaires des protéines de ciment (CP) formant le complexe de ciment. Des études antérieures ont montré que le ciment est fait de nanofibrilles de type amyloïde qui peuvent contribuer à l’adhérence. Cependant, la protéine responsable de la formation de ces nanofibrilles reste inconnue. Dans cette étude, les caractéristiques morphologiques à l’échelle nanométrique des protéines de ciment recombinantes (CP) de la balane Megabalanus rosa (MrCP19 et MrCP20, avec les chiffres indiquant un poids moléculaire de 19 kDa et 20 kDa respectivement) ont été caractérisées par la mesure du dichroïsme circulaire (CD), le test Thioflavin T (ThT), la microscopie à force atomique (AFM) et la microscopie électronique à transmission (TEM), suggérant le potentiel de former des structures nano-fibrillaires dans certaines conditions. Sur la base de la structure primaire et de la morphologie de surface des protéines, des études mécaniques, biochimiques et antimicrobiennes ont été menées pour comprendre les rôles uniques de ces protéines interfaciales sur la croissance des balanes et le processus d’attachement à la surface, par exemple la biominéralisation et le contrôle de la biodégradation. Les mesures effectuées à l’aide de l’appareil de force de surface (SFA) et de la microbalance à cristaux de quartz avec surveillance de la dissipation (QCM-D) ont montré que les interactions électrostatiques jouent un rôle clé dans l’adsorption et l’adhésion de surface de MrCP19 et MrCP20. En outre, l’influence mutuelle de la croissance de la plaque de base de bernacle (minéralisation de carbonate de calcium) et de la fibrillation de la protéine de ciment MrCP20 adjacente a été étudiée à l’aide de surfaces d’or fonctionnalisées monocouches (SAM) auto-assemblées, de spectroscopie Raman, de QCM-D, de spectromètre photoélectronique à rayons X (XPS) et de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier à réflectance totale atténuée (ATR-FTIR). Parallèlement, l’influence du substrat externe adjacent à la protéine de ciment MrCP19 sur les cellules bactériennes présentes dans le biofilm sur les surfaces sous-marines en milieu marin a été démontrée à l’aide de différents tests microbiologiques, notamment le test de zone d’inhibition, le test de concentration minimale inhibitrice (CMI), la MET, l’étude de fluorescence, etc. Plus intéressant encore, une hypothèse intrigante concernant le processus de fibrillation amyloïde et l’activité antimicrobienne a été suggérée. Sur la base de ces examens préliminaires, les deux PC interfaciaux ont montré des responsabilités potentielles distinctes sur le tassement des bernacles, non seulement avec son adhérence, mais aussi avec d’autres rôles fonctionnels aux interfaces. Ces travaux amélioreront nos connaissances sur les contributions individuelles de MrCP19 et MrCP20 dans le complexe cimentier et donc dans la capacité globale d’adhésion sous-marine des balanes. À cet égard, la thèse vise à fournir des lignes directrices moléculaires pour le développement de mimiques polymères inspirés des PC (à base de peptides ou de protéines) à partir de ce système moléculaire bio-adhésif.

Barnacles adhere themselves robustly and permanently to diverse underwater substrates through strong interactions of a multi-protein complex layer called the “cement”. However, the intermolecular interactions responsible for the strong adhesive properties of the barnacle cement remains poorly understood. A central hypothesis of this thesis is that underwater properties of the cement complex are intimately linked to the molecular characteristics of cement proteins (CPs) forming the cement complex. Previous studies have shown that the cement is made of amyloid-like nanofibrils that may contribute to adhesion. However, the protein responsible for the formation of these nanofibrils remain unknown. In this study, the nanoscale morphological features of recombinant cement proteins (CPs) from the barnacle Megabalanus rosa (MrCP19 and MrCP20, with the numbers indicating molecular weight of 19 kDa and 20 kDa respectively) were characterized by Circular Dichroism (CD) measurement, Thioflavin T (ThT) assay, Atomic Force Microscopy (AFM), and Transmission Electron Microscopy (TEM), suggesting the potential to form nano-fibrillar structures under certain conditions. Based on the proteins’ primary structure and surface morphology, mechanical, biochemical, and antimicrobial studies were conducted to understand the unique roles of these interfacial proteins on barnacle growth and surface attachment process, for instance biomineralization and biodegradation control. Measurements using Surface Force Apparatus (SFA) and Quartz Crystal Microbalance with Dissipation monitoring (QCM-D) illustrated that electrostatic interactions play a key role in surface adsorption and adhesion of MrCP19 and MrCP20. In addition, the mutual influence of barnacle base plate growth (calcium carbonate mineralization) and the adjacent cement protein MrCP20 fibrillation was investigated using self-assembled monolayer (SAM) functionalized gold surfaces, Raman spectroscopy, QCM-D, X-ray photoelectron spectrometer (XPS), and Attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR). Concurrently, the influence of the external substrate adjacent cement protein MrCP19 on bacteria cells which are present in biofilm on underwater surfaces in marine environment was demonstrated using different microbiology tests including zone of inhibition test, Minimum inhibitory concentration (MIC) assay, TEM, fluorescence study, and so on. More interestingly, an intriguing hypothesis regarding amyloid fibrillation process and antimicrobial activity was suggested. Based on these preliminary examinations, the two interfacial CPs showed distinctive potential responsibilities on barnacle settlement not only with its adhesion but also with other functional roles at the interfaces. This work will improve our knowledge about individual contributions of MrCP19 and MrCP20 in cement complex and hence in overall underwater adhesion capacity of barnacles. In this regard, the thesis aims at providing molecular guidelines towards the development of CPs inspired polymeric (peptide or protein based) mimics from this bio-adhesive molecular system.