Orchestration de l'extrusion cellulaire par les caspases effectrices

Orchestration of epithelial cell elimination by effector caspases

• Auteur / Autrice : Alexis Villars
• Direction : Romain Levayer
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et développement
• Date : Soutenance le 12/09/2022
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Mort cellulaire et homéostasie des épithéliums
• Jury : Président / Présidente : Michel Labouesse
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Rashmi Priya
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Magali Suzanne, Jakub Sedzinski

Mots clés

Mots clés contrôlés

Morphogenèse

Épithélium

Apoptose

Extrusion (biologie cellulaire)

Mots clés libres

Cell extrusion

Apoptose

Microtubules

Morphogenesis

Cell extrusion

Apoptosis

Microtubules

Morphogenesis

Résumé

Les épithéliums sont des tissus constitués de cellules très adhérentes les unes aux autres. Grâce à cela, les épithéliums agissent comme une barrière et protègent les organes qu'ils enveloppent des dangers extérieurs tels que les infections. Cependant, les épithéliums sont loin d'être statiques et présentent des taux élevés de renouvellement cellulaire par division et mort cellulaire. C'est un défi pour le tissu car la fragmentation des cellules mourantes peut entraîner une perte d'étanchéité du tissu et donc mettre en danger les organes qu'ils protègent. Pour pallier cela, les cellules apoptotiques sont expulsées des épithéliums par une séquence d'événements de remodelage qui contractent la cellule tout en rapprochant ses voisines. Ce processus, appelé extrusion cellulaire, contribue à maintenir l'étanchéité des tissus pendant la mort cellulaire. Cependant, la façon dont la cellule prend la décision d'extruder, et les mécanismes qui conduisent à sa contraction sont mal connus. Pour étudier ce phénomène, nous utilisons l'épithélium monocouche du notum de la pupe de drosophile. Dans ce tissu, l'activation des caspases précède et est nécessaire à l'extrusion cellulaire. L'extrusion cellulaire a été principalement analysée à travers l'étude de la régulation de l'actomyosine. Cependant, la relation entre l'activation des caspases et l'extrusion cellulaire est encore mal comprise. Nous avons montré que, contrairement à ce qui était anticipé, l'initiation de l'extrusion cellulaire et la constriction apicale ne sont pas associées à la modulation de la concentration ou de la dynamique de l'actomyosine. Au contraire, la constriction apicale des cellules est initiée par le désassemblage d'un réseau médio-apical de microtubules par l’action des caspases effectrices. Il est important de noter que la déplétion des microtubules est suffisante pour passer outre le besoin de caspases pour l'extrusion cellulaire. De plus, la stabilisation des microtubules nuit fortement à l'extrusion cellulaire. Ces résultats démontrent pour la première fois que le désassemblage des microtubules par les caspases est une importante étape limitante de l’extrusion. En outre, elle met en évidence une fonction plus générale des microtubules dans la stabilisation de la forme des cellules épithéliales. En outre, comme les caspases clivent une grande quantité de substrat, l'activation des caspases a longtemps été considérée comme un point de non-retour conduisant irréversiblement à l'apoptose. Cependant, des études récentes ont montré des fonctions non apoptotiques des caspases. Ces fonctions sont vastes et impliquées dans la différenciation cellulaire, la prolifération, le maintien de la pluripotence et bien d'autres. De même, plusieurs travaux montrent des événements d'activation transitoire des caspases. Par conséquent, ce qui établit la balance entre les niveaux de caspase non létaux et l'engagement dans l'apoptose reste peu clair. Il a été proposé que les cellules survivent jusqu'à un seuil d'activation des caspases, mais cela n'a jamais été testé. Si un tel seuil existe, la manière dont sa valeur est fixée et est modulée n'est pas claire. Pour quantifier l’engagement des cellules dans l’extrusion, nous avons utilisé un rapporteur live de caspase et systématiquement segmenté et suivi les cellules du notum. Par régression logistique, nous avons montré qu'il n'y a pas de seuil commun d'activité des caspases effectrices menant à l'extrusion. Au contraire, les niveaux de caspases sont corrélés linéairement avec la probabilité d’engagement dans l'extrusion. De plus, par statistique bayésienne, nous avons pu identifier des paramètres prédictifs de la sensibilité des cellules aux caspases. Par exemple l'activation antérieure des caspases semble être associée à l'engagement dans l'extrusion à un niveau de caspase inférieur. Ceci est la première analyse quantitative du processus d'engagement dans l'extrusion ou l'apoptose in vivo et au niveau de la cellule unique.

Epithelia are tissues made up of cells that are highly adherent to each other. Thanks to this property, epithelia act as a barrier and protect the organs they encase from external dangers such as infections. However, epithelia are far from static and exhibit high rates of cell turnover through cell division and death. This is a challenge for the tissue because the fragmentation of dying cells can result in a loss of tissue sealing and thus potentially endanger the organs they protect. To address this problem, apoptotic cells are expelled from the epithelia by a sequence of remodelling events that contract the cell while bringing its neighbours together. This process is called cell extrusion and it helps maintain tissue sealing during cell death. However, how the cell makes the decision to extrude and what are the mechanisms that lead to its contraction are not well known. To study this phenomenon, we use the monolayer epithelium of the Drosophila pupa notum. In this tissue, caspase activation precedes and is necessary for cell extrusion. Cell extrusion has been mostly analysed through the study of actomyosin regulation. Yet, the mechanistic relationship between caspase activation and cell extrusion is still poorly understood. We showed that the initiation of cell extrusion and apical constriction are surprisingly not associated with the modulation of actomyosin concentration and dynamics. Instead, cell apical constriction is initiated by the disassembly of a medio-apical mesh of microtubules driven by effector caspases. Importantly, the depletion of microtubules is sufficient to bypass the requirement of caspases for cell extrusion. Additionally, microtubule stabilisation strongly impairs cell extrusion. This demonstrates for the first time that microtubules disassembly by caspases is an important rate-limiting step of extrusion. Moreover, it outlines a more general function of microtubules in epithelial cell shape stabilisation. Additionally, because caspase cleave a large amount of substrate, caspase activation was long seen as a point of no-return irreversibly leading to apoptosis. However, recent studies showed non-apoptotic functions of caspases. These non-apoptotic functions are broad and involved for instance in cell differentiation, proliferation, maintenance of pluripotency and many others. Similarly, our work and other’s showed events of transient caspase activation. Therefore, what sets the balance between non-lethal caspase levels and the irreversible commitment in apoptosis remains unclear. It has been proposed that cells can survive up to a certain threshold of caspase activation but was never tested. If such threshold indeed exists, how its value is set and modulated is unclear. We used a live caspase reporter and systematic segmentation of cells in the notum to quantify the engagement of cell in extrusion. Using logistic regression, we showed that there is no common threshold of effector caspase activity leading to extrusion. Rather, caspases levels correlate linearly with the probability to engage in extrusion. Furthermore, using Bayesian statistical analysis we were able to identify parameters predictive of cell sensitivity to caspase. We showed for instance that past caspase activation seems to be associated with the engagement in extrusion at a lower caspase level. This is the first quantitative analysis of the engagement process in extrusion or apoptotis in vivo and at the single cell level.