Propriétés mécaniques des filaments de septines et leur rôle dans la formation de barrières de diffusion

Mechanical Properties of Septins and Their Role in Establishing Diffusion Barriers

• Auteur / Autrice : Brieuc Chauvin
• Direction : Stéphanie Mangenot, Aurélie Bertin, Bassam Hajj
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physique
• Date : Soutenance le 15/11/2022
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Physique en Île-de-France (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Physique des Cellules et Cancer (Paris ; 2024-....)
• Jury : Président / Présidente : Georges Debrégeas
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Baptiste Masson, Simonetta Piatti
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Manuel Théry, Yves Barral

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines du cytosquelette

Septines

Membranes (biologie)

Diffusion (physique)

Biophysique

Mots clés libres

Septines

Diffusion

Membranes biomimétiques

Septins

Diffusion

Biomimetic membranes

Résumé

Les septines sont des protéines filamenteuses ubiquitaires considérées comme le quatrième élément du cytosquelette. Elles jouent un rôle dans la stabilisation mécanique de la membrane plasmique et sont impliquées dans l'établissement de barrières de diffusion in vivo, permettant la compartimentation des membranes. Bien que les barrières de diffusion soient essentielles à de nombreux processus cellulaires, les principes biophysiques qui régissent leurs fonctions sont encore mal compris. Les systèmes reconstitués in vitro sont de bons modèles pour comprendre le rôle des septines dans la formation de ces barrières car ils permettent le contrôle de l'ensemble des paramètres biophysiques. J'ai utilisé un système de membranes biomimétiques (liposomes et bicouche supportée) pour étudier comment la diffusion des lipides et des protéines ancrées aux membranes est modifiée en présence d’un réseau de septine. J'ai utilisé une combinaison de méthodes (Recouvrement de Fluorescence Après Photoblanchiment et Suivi de Particules Uniques) pour analyser la dynamique des lipides et des protéines membranaires en présence de filaments de septines de levure liés à des membranes biomimétiques. J'ai modélisé l'encombrement stérique des protéines connues pour être séquestrées en présence de septines grâce à trois protéines modèles dont les domaines extra-membranaires (cytosoliques) varient en taille : l'aquaporine (canal aqueux sans domaine cytosolique), la streptavidine (environ 6~nm) liée à des lipides possédant une biotine, et les points quantiques (environ 20~nm), liés à la membrane par un lien streptavidine-biotine. La diffusion des lipides n'est pratiquement pas affectée par la présence de filaments de septine. En revanche, la diffusion des protéines modèles est modifiée en fonction de leur dimension. Les expériences de Suivi de Particules Uniques montrent une diffusion libre de l'aquaporine, proche du mouvement Brownien, tandis que les points quantiques sont piégés dans des régions linéaires contraintes par des filaments parallèles de septine. Enfin, la streptavidine présente deux populations distinctes de particules: immobiles et sous-diffusive. Selon la taille du domaine cytosolique du modèle, les septines affectent donc différemment son comportement diffusif, agissant de manière similaire à un ''filtre'' des composants liés à la membrane. En outre, j'ai comparé l'impact de l’organisation des filaments de septines sur la restriction de la diffusion des composants liés à la membrane. L'utilisation de septines humaines ou l'ajout de protéines de réticulation aux septines de levure induit l'auto-assemblage de réseaux orthogonaux de filaments sur les membranes. En présence de ces réseaux, la diffusion des points quantiques est totalement entravée. Mes observations pointent vers un effet stérique créé par la présence du réseau de septines et sont en bon accord avec les observations in vivo. Enfin, dans la continuité de travaux antérieurs, j'ai étudié les propriétés mécaniques de filaments de septine liés à des membranes lipidiques. Il a été démontré que les septines affectent les propriétés mécaniques des membranes plasmiques et les observations faites lors des études précédentes restaient énigmatiques. J'ai observé, en réalisant des expériences d'aspiration par micropipette, que les septines étaient capables d'empêchant la déformation de la vésicule. J'ai déterminé, en utilisant la technique d'indentation par Microscopie à Force Atomique sur des GUVs, que les filaments de septine peuvent réduire le module de compressibilité surfacique apparent des vésicules, ce qui était inattendu. Un modèle qui tient compte d'une déformation initiale de la membrane dépendant de la septine permet d'estimer le module de flexion d’un réseau de septine. Ce module de flexion est en accord avec les valeurs connues de la longueur de persistance des filaments de septine et explique l'observation expérimentale contre-intuitive.

Septins are ubiquitous filamentous proteins considered as the fourth element of the cytoskeleton. Septins play a role in the mechanical stabilization of the plasma membrane and are involved in the establishment of diffusion barriers in vivo, allowing the compartmentalization of membranes. Even though diffusion barriers are essential to many cellular processes, the biophysical principles regulating their functions are still poorly understood. Bottom-up in vitro reconstituted systems offer powerful tools to understand the role of septins in forming those barriers by controlling independently all the biophysical parameters. During my PhD, I used a system of biomimetic membranes (liposomes and supported bilayer) to study how the diffusion of lipids and proteins anchored to membranes is impacted by the presence of a septin mesh. I have used a combination of methods -- namely Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Single Particle Tracking (SPT) -- to assay the dynamics of lipids and membrane bound proteins in the presence of yeast septin filaments bound to biomimetic membranes. I analysed the diffusion of different model proteins, with varying sizes of the extra-membrane (cytosolic) domains: aquaporin (a transmembrane water channel with no cytosolic domain), streptavidin (about 6 nm) bound to biotin lipids, and quantum dots (about 20 nm), bound to the membrane through a streptavidin-biotin linker. Hence, I have modelled the steric hindrance of membrane bound proteins that are known to be sequestrated in the presence of septins. The diffusion of lipids is barely impacted by the presence of septin filaments. However, the diffusion of model systems mimicking membrane proteins can be altered depending on their dimension. SPT diffusion analysis shows a freely diffusive behaviour of aquaporin, close to Brownian motion, while quantum dots, are trapped in linear regions constrained by sets of parallel septin filaments. Finally, streptavidin displays two distinct populations of immobile and sub-diffusing particles. Depending on the size of the cytosolic domain, septins thereby affect differently their diffusive behavior, acting similarly to a ''filter'' of membrane bound components. Besides, I have compared the impact of different structural organization of septins on the diffusion restriction of membrane bound components. Using human septins or adding cross-linking proteins to yeast septins induce the self-assembly of orthogonal networks of filaments on membranes. In the presence of those networks, the diffusion of quantum dots is fully impaired. My observations point towards a steric effect created by the presence of the septin network and are in good agreement with the in vivo observations. Finally, following up previous work, I studied the mechanical properties of lipid membranes with septin filaments bound. Indeed, septins have been shown to affect the mechanical properties of plasma membranes and former observations remained puzzling. I observed, performing micropipette aspiration experiments, that septins were able to rigidify the membrane, preventing its deformation. I determined, using Atomic Force Microscopy indentation on GUVs, that septin filaments can reduce the apparent area compressibility modulus of vesicles, which was unexpected. A model that accounts for a septin dependent initial deformation of the vesicles can estimate the bending modulus of a septin mesh. This bending modulus is in good agreement with the known values of persistence length of single septin filaments and accounts for the counter-intuitive experimental observation.